作者rickkao11 (rickkao11)
看板Biotech
标题[求救] Luciferase assay
时间Tue Aug 23 23:14:03 2011
使用的是promega的kit
每次加入40ul的substract 和 20ul的sample
在黑色九十六孔盘中读一秒
可是几次实验做下来
每次的结果都不太一样
有时候多有时候少
在萤光显微镜下看trasfection的效率都差不多(用GFP)
请问大家在做luciferase assay时有没有什麽需要注意的地方
可以降低差异的发生
谢谢!!!
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.211.200
1F：推 iceking:试试Dual luciferase assay , 效率用看的不准~ 08/23 23:20
谢谢，实验室有试用过这个Kit，可是我们加的东西似乎会影响到另外的那个plasmid
表现，用那个normalize之後数剧就平掉了，所以後来就没用dual了
後来都只能大约用protein assay来normalized
※ 编辑: rickkao11 来自: 140.112.211.200 (08/23 23:40)
2F：推 chxx:应该用白色的阿 黑色会吸光 08/24 02:42
3F：推 HEK293:用黑盘背景会低一点，只用protein定量有盲点 08/24 09:03
4F：→ HEK293:可以的话还是用renilla比较好，平掉就是没趋势阿= = 08/24 09:04
5F：→ HEK293:顺便补充，是substrate 08/24 09:04
6F：推 iceking:差异的话，关键应该是在cell culture的部分 08/24 10:10
7F：推 Realthugz:每次细胞数有差不多吗 或生长情况差不多 08/24 11:32
8F：→ Realthugz:我是会co-transfect beta-gal做normalization 08/24 11:33
9F：推 iceking:细胞的变数相当的多,光是有没有均匀的seed就是一门学问 08/24 23:17
10F：→ iceking:然後seed细胞後,隔多久时间开始做transfection,这也重要. 08/24 23:18
11F：→ iceking:如果要overnight,细胞就开始繁殖,细胞数可能就会不一样多 08/24 23:18
12F：→ iceking:所以有没有需要做serum starvation也要评估. 08/24 23:19
13F：→ iceking:虽然现在的kit大多都说serum不会影响transfection,但依照 08/24 23:20
14F：→ iceking:经验,serum free的transfection效果还是比较好,当然,有 08/24 23:20
15F：→ iceking:commercial的OPTI-MEM的话就用. 08/24 23:21
16F：→ iceking:然後,也是最重要的一点,就是Luciferase不建议和萤光一起 08/24 23:23
17F：→ iceking:送进细胞,我以前曾经这样做过,但在测量冷光及萤光数值时 08/24 23:24
18F：→ iceking:非常困扰,我还要把well中的细胞平均分到白盘&黑盘当中 08/24 23:25
19F：→ iceking:测出来变异相当的大. 後来我就改用dual assay了! 08/24 23:26
20F：推 iceking:dual的plasmid比例很重要,千万别一味的1:1送进细胞,多try 08/24 23:28
21F：→ iceking:几种不同condition 或许plasmid就表现了~ 08/24 23:29
22F：→ rickkao11:谢谢楼上!!! 08/25 17:57