借這個標題問一下，因為我也遇到類似的問題…… 我要做一個 14.7 kb 的 construct，insert 就有 10 kb， 而且裡面有非常多個 repeat sequence。 Insert 的來源是跟國外實驗室要來的，他們告訴我，他們都是使用 Stbl2 這種 cell strain 要保存這麼高度 repeat 又大 size 的 plasmid DNA。 然後我要把這段 10 kb 的 insert 剪接到其他的 vector 上， 卻是怎麼做都不成功！Orz 因為我們實驗室只有 DH5α，所以我只能將 ligastion 的產物 transformt 到 DH5α… 而且我也試著在 30℃ 培養。 但是，每次做出來的 construct，在用 RE check 的時候，都發現確實有insert 接 進去，卻都是被剪切過的……Orz 而且大大小小的 size 都有，表示被剪切的情況 還不一…… （而且我是使用抗 Kanamycine 的 vector，雜菌的機率很低……） 請問有沒有人有類似 construct 這麼大尺碼的 DNA，又包含高度 repeat sequence 的經驗呢？除了放在 30℃ 培養，還有沒有其它可以避免它被剪切？ 或者，有誰的實驗室有 stbl2 這株 E.coli strain，方便給我2~3管的？ （若有必要，我會請我們老師親自詢問你們老闆的~） 感謝大家。<(_ _)> ※ 引述《hdf87ery (hdf87ery)》之銘言： : 標題: [討論]請問哪個e.coli strain比較不會自己剪切plasmid? : 時間: Tue Jun 23 19:27:48 2009 : : 事情是這樣的 : 我construct一個大約１４.5kb左右的plasmid transformt到DH5a後挑出 : 第一天養個幾cc做確認時沒有發現任何雜plasmid : 第二天,拿一點第一天菌做subculture後抽plasmid發現會出現雜plasmid : : 1.拿第二天的菌做streak,可以分離出我要的plasmid跟雜plasmid : 分離出的菌再經過第1天的培養確認,沒再出現雜plasmid,但再養第二天時 : 那雜plasmid就又出現了 : 2.雜plasmid切出來的BAND都與前一天結果一樣,但我沒個別分離出來抽plasmid確認, : 只是與我要的plasmid混在一起看的,能辦認出的酵素除了single cut外 : 只有另外二個酵素 : 許多酵素切出來的長度幾乎是重合的,但是如果經過第三天的培養後 : 可看出一些低bp的BAND會比高bp的BAND還亮 : 所以我想有可能是菌自己剔掉的 : 這部份是否有可能? : 3.有用plasmid另外transform一次,但結果跟streak一樣 : 4.LB方面應該沒汙染,人為操作方面就不太確定了 : 5.假如我推測沒錯的話,有哪些strain比較不會剔plasmid呢? : 我的construct有PGK,Neomycin,polyA,SV40polyA,rabbit B-globin polyA : loxP,我的基因,其他genome序列, : 6.還有哪些情況會導致我這結果發生? : : : -- :

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) : ◆ From: 140.130.98.94 : 推 tsubasawolfy:有沒有可能是序列跟DH5A chromosome相近造成一些 06/23 20:08 : → tsubasawolfy:repair system或者RE相近也作用在上面? 06/23 20:08 : 推 jsi:plasmid較大時常見這種剪接現象 我是重新設計construct只保留 06/23 22:36 : → jsi:必須要的部份 盡量讓plasmid小於10K 不知是否有人可提供如何養 06/23 22:38 : → jsi:超大plasmid的訣竅呢? 06/23 22:39 : 推 blence:有篇paper要clone一個10kb的gene就用STBL2這個strain,而且 06/23 23:25 : → blence:除了跟invitrogen買，台灣還有一些lab保留 06/23 23:26 : 推 williamyang:我現在用STBL3,效果還不錯. 06/23 23:52 : 推 yaliu:可以問一下嗎？為什麼菌會剔掉plasmid?DH5a不是已經把一些 06/24 02:24 : → yaliu:基因做突變了嗎？recA endA之類的，不是應該可以穩定保存 06/24 02:26 : → yaliu:質體？？？ 06/24 02:26 : 推 rimeni:養在30度而不要養在37度~ 06/24 11:53 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.213.149 ※ 編輯: desirable 來自: 140.120.213.149 (08/10 18:28) 我想應該是沒有亂切，我是用 SalI 和 BamHI 把 insert 從原本的 vector 切下來， 再用這兩個切位接到 GFP vector 的 MCS 裡面。 RE check 的時候也是用 SalI 和 BamHI 做 check，同時以 insert 來源的 plasmid 作為 control。Insert 來源的 plasmid 很順利地用 SalI 和 BamHI 切出 10 kb 的 band，而我做的 construct 卻只能切出 9 kb 左右的 insert（當我再做一次的時候 更誇張，各種長長短短的 insert 都有，vector 的尺寸倒是非常標準一致的 4.7 kb）。 我也有將 construct 送定序……定出來的東西是 GFP vector + E. coli 的 genomic DNA……冏rz （GFP vector 上的序列剛好對到 SalI，就是我接進 insert 的切位，從 SalI site 以後的序列就變成 genomic DNA ……我猜這應該是我有 成功的把 insert 接到 vector，只是它重組了！冏rz冏rz冏rz） 我有把 12hr、24hr、48hr 這三個時間點長出來的 colonies 各挑幾顆，結果都一樣… 請問為什麼放的時間不夠久，挑到的就會是切斷的呢？謝謝。 ※ 編輯: desirable 來自: 140.120.213.149 (08/11 11:11) 真是感謝分享！！ 您好像這方面經驗很豐富，請問關於「放的時間不夠久,挑到的是del mutant的機會 就大」這件事有沒有相關的 reference 可以參考呢？因為我對這方面是只知其然而 不知其所以然…… 原來養mini的時候也這麼嚴格，我會再試試看的。 請問還有沒有什麼訣竅或是要注意的地方呢？ 又如果，我都是養了 mini 之後再拿去養 Mexi，然後才用 Mexi 抽 DNA，要怎麼判斷 那管菌液能不能用呢？是不是也要放在 30℃ 養到 48hr 才可以收呢？ 是呀，但是我第一次 transform，是放在 37℃ 培養 12hr，長了兩顆，挑起來養 mini （也是 37℃）後抽 DNA，用 RE check 卻是錯的。 第二次 transform，也是放在 37℃ 培養 12hr 挑起來養 mini 也是 37℃）後抽 DNA， 用 RE check 是對的。然後我是用這批產物去做 construct。我當時還沒有「要放在 30℃培養的觀念，所以現在我有點擔心，會不會這批 plasmid DNA 也有重組，只是我用 RE check 時剛好看不出來而已……正在考慮要不要連這個 plasmid 也重新 transform 再養菌抽 DNA…… 再次感謝你的分享~我為這個 construct 折騰一年半了，現在總算看到曙光…… 我真的很希望能把它做出來，希望下一次可以成功！ ※ 編輯: desirable 來自: 140.120.213.149 (08/11 13:49)