借这个标题问一下，因为我也遇到类似的问题…… 我要做一个 14.7 kb 的 construct，insert 就有 10 kb， 而且里面有非常多个 repeat sequence。 Insert 的来源是跟国外实验室要来的，他们告诉我，他们都是使用 Stbl2 这种 cell strain 要保存这麽高度 repeat 又大 size 的 plasmid DNA。 然後我要把这段 10 kb 的 insert 剪接到其他的 vector 上， 却是怎麽做都不成功！Orz 因为我们实验室只有 DH5α，所以我只能将 ligastion 的产物 transformt 到 DH5α… 而且我也试着在 30℃ 培养。 但是，每次做出来的 construct，在用 RE check 的时候，都发现确实有insert 接 进去，却都是被剪切过的……Orz 而且大大小小的 size 都有，表示被剪切的情况 还不一…… （而且我是使用抗 Kanamycine 的 vector，杂菌的机率很低……） 请问有没有人有类似 construct 这麽大尺码的 DNA，又包含高度 repeat sequence 的经验呢？除了放在 30℃ 培养，还有没有其它可以避免它被剪切？ 或者，有谁的实验室有 stbl2 这株 E.coli strain，方便给我2~3管的？ （若有必要，我会请我们老师亲自询问你们老板的~） 感谢大家。<(_ _)> ※ 引述《hdf87ery (hdf87ery)》之铭言： : 标题: [讨论]请问哪个e.coli strain比较不会自己剪切plasmid? : 时间: Tue Jun 23 19:27:48 2009 : : 事情是这样的 : 我construct一个大约１４.5kb左右的plasmid transformt到DH5a後挑出 : 第一天养个几cc做确认时没有发现任何杂plasmid : 第二天,拿一点第一天菌做subculture後抽plasmid发现会出现杂plasmid : : 1.拿第二天的菌做streak,可以分离出我要的plasmid跟杂plasmid : 分离出的菌再经过第1天的培养确认,没再出现杂plasmid,但再养第二天时 : 那杂plasmid就又出现了 : 2.杂plasmid切出来的BAND都与前一天结果一样,但我没个别分离出来抽plasmid确认, : 只是与我要的plasmid混在一起看的,能办认出的酵素除了single cut外 : 只有另外二个酵素 : 许多酵素切出来的长度几乎是重合的,但是如果经过第三天的培养後 : 可看出一些低bp的BAND会比高bp的BAND还亮 : 所以我想有可能是菌自己剔掉的 : 这部份是否有可能? : 3.有用plasmid另外transform一次,但结果跟streak一样 : 4.LB方面应该没污染,人为操作方面就不太确定了 : 5.假如我推测没错的话,有哪些strain比较不会剔plasmid呢? : 我的construct有PGK,Neomycin,polyA,SV40polyA,rabbit B-globin polyA : loxP,我的基因,其他genome序列, : 6.还有哪些情况会导致我这结果发生? : : : -- :

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) : ◆ From: 140.130.98.94 : 推 tsubasawolfy:有没有可能是序列跟DH5A chromosome相近造成一些 06/23 20:08 : → tsubasawolfy:repair system或者RE相近也作用在上面? 06/23 20:08 : 推 jsi:plasmid较大时常见这种剪接现象 我是重新设计construct只保留 06/23 22:36 : → jsi:必须要的部份 尽量让plasmid小於10K 不知是否有人可提供如何养 06/23 22:38 : → jsi:超大plasmid的诀窍呢? 06/23 22:39 : 推 blence:有篇paper要clone一个10kb的gene就用STBL2这个strain,而且 06/23 23:25 : → blence:除了跟invitrogen买，台湾还有一些lab保留 06/23 23:26 : 推 williamyang:我现在用STBL3,效果还不错. 06/23 23:52 : 推 yaliu:可以问一下吗？为什麽菌会剔掉plasmid?DH5a不是已经把一些 06/24 02:24 : → yaliu:基因做突变了吗？recA endA之类的，不是应该可以稳定保存 06/24 02:26 : → yaliu:质体？？？ 06/24 02:26 : 推 rimeni:养在30度而不要养在37度~ 06/24 11:53 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.213.149 ※ 编辑: desirable 来自: 140.120.213.149 (08/10 18:28) 我想应该是没有乱切，我是用 SalI 和 BamHI 把 insert 从原本的 vector 切下来， 再用这两个切位接到 GFP vector 的 MCS 里面。 RE check 的时候也是用 SalI 和 BamHI 做 check，同时以 insert 来源的 plasmid 作为 control。Insert 来源的 plasmid 很顺利地用 SalI 和 BamHI 切出 10 kb 的 band，而我做的 construct 却只能切出 9 kb 左右的 insert（当我再做一次的时候 更夸张，各种长长短短的 insert 都有，vector 的尺寸倒是非常标准一致的 4.7 kb）。 我也有将 construct 送定序……定出来的东西是 GFP vector + E. coli 的 genomic DNA……冏rz （GFP vector 上的序列刚好对到 SalI，就是我接进 insert 的切位，从 SalI site 以後的序列就变成 genomic DNA ……我猜这应该是我有 成功的把 insert 接到 vector，只是它重组了！冏rz冏rz冏rz） 我有把 12hr、24hr、48hr 这三个时间点长出来的 colonies 各挑几颗，结果都一样… 请问为什麽放的时间不够久，挑到的就会是切断的呢？谢谢。 ※ 编辑: desirable 来自: 140.120.213.149 (08/11 11:11) 真是感谢分享！！ 您好像这方面经验很丰富，请问关於「放的时间不够久,挑到的是del mutant的机会 就大」这件事有没有相关的 reference 可以参考呢？因为我对这方面是只知其然而 不知其所以然…… 原来养mini的时候也这麽严格，我会再试试看的。 请问还有没有什麽诀窍或是要注意的地方呢？ 又如果，我都是养了 mini 之後再拿去养 Mexi，然後才用 Mexi 抽 DNA，要怎麽判断 那管菌液能不能用呢？是不是也要放在 30℃ 养到 48hr 才可以收呢？ 是呀，但是我第一次 transform，是放在 37℃ 培养 12hr，长了两颗，挑起来养 mini （也是 37℃）後抽 DNA，用 RE check 却是错的。 第二次 transform，也是放在 37℃ 培养 12hr 挑起来养 mini 也是 37℃）後抽 DNA， 用 RE check 是对的。然後我是用这批产物去做 construct。我当时还没有「要放在 30℃培养的观念，所以现在我有点担心，会不会这批 plasmid DNA 也有重组，只是我用 RE check 时刚好看不出来而已……正在考虑要不要连这个 plasmid 也重新 transform 再养菌抽 DNA…… 再次感谢你的分享~我为这个 construct 折腾一年半了，现在总算看到曙光…… 我真的很希望能把它做出来，希望下一次可以成功！ ※ 编辑: desirable 来自: 140.120.213.149 (08/11 13:49)