作者Doraemon7817 (樂在學習)
看板Biotech
標題[求救] 蛋白質濃度測不準...pipetman操作問題?
時間Sat Jul 30 03:54:19 2011
大家好，第一次在這裡發文請多指教> <
我是今年的碩一新生，最近在實驗室裡學習跑western
再跑之前有先去測蛋白質濃度，但測出來發現
我的standard做得非常不準...我的R值只有0.95.....(學長說要0.99才夠準)
但我在操作的過程中都有學長在旁檢視、提點，所以應該是沒有加錯東西
再討論過後推測可能是我的pipetman操作不當，量取不精準所致...
固定protein濃度後去跑膠，結果今天壓片出來，我的兩條band竟然差了快兩倍!!!
(一樣濃度應該要一樣粗啊> <)所以是我真的加得很不準= =a
可是我並非第一次接觸pipetman啊~大學時期曾待過實驗室一年
(不過以前實驗並沒有要求非常精準，所以可能問題一直存在只是我現在才發現= =)
也知道pipetman有兩段，第一段吸、第二段放...
我有先稍微爬了一下文，去看pipetman的操作
再由低轉到高時也會轉超過才轉至我要的值
跟學長姐討論後，他們說因素太多了，有可能是我吸放的速度太快
或是讓protein殘留在tip上過多...等，不過因為他們都沒有這樣的狀況
所以也不知道究竟問題在哪...(只有我有這樣的問題...我的手在搞甚麼啊QQ...)
目前是叫我就繼續多練習找找手感
不過我希望能降低失敗次數不要浪費前輩們的時間及老師的金錢> <
所以想請教各位(有人遇過這情形嗎T^T)在加東西的時候該怎麼加比較準確?
是先加在管壁上然後再離心?
還是要稍微碰到液面加?
亦或是要懸空加??
然後吸跟放的速度都是要慢一點???(不過我有時慢放又會有一點點液體倒吸回tip上ˊˋ)
我的問題好笨喔ˊˋ但還是懇請大家提供一點心得或意見...
感激不盡
謝謝: )
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.134.145.35
1F：推 even2300471:吸放都要慢 特別是較黏溶液 07/30 12:08
2F：→ even2300471:放的時候tip在液面下按到底 抽出 07/30 12:08
3F：→ even2300471:來再放開就可避免倒吸 07/30 12:09
4F：推 shenhsu:上次有sales建議 要先吸放個3-5次 讓tip管壁上先有液體 07/30 13:08
5F：→ shenhsu:之後排掉重吸才準 因為管壁上很多細小不平的痕跡會卡液體 07/30 13:10
6F：→ shenhsu:另外個人比較偏向加到液體裡 加管壁上感覺就會有部分殘留 07/30 13:12
7F：→ gryou:用水多練習找手感 可以順便稱重觀察 07/30 15:28
8F：→ Doraemon7817:謝謝大家~我會試試，下星期會再測一次濃度，到時就 07/30 21:00
9F：→ Doraemon7817:可以知道成果了@@真緊張~ 07/30 21:01
10F：推 iyogirl:我是在液面上吐出一點小水珠讓它跟液面連接緩慢吐完液體 07/30 22:19
11F：→ iyogirl:不要讓tip與液體接觸 我也是95被操到99的 加油喔! 07/30 22:21
12F：推 cronos:個人覺得吸放3-5次很關鍵 話說以前lab的標準是0.995(遠目 07/30 22:26
13F：→ cronos:不要太緊張 做實驗前先"冥想"每一個步驟 忌手忙腳亂XD 07/30 22:27
14F：推 yaliu:是用BioRad protein assay dye?用分光光度計測還是96well盤? 07/31 00:31
15F：→ yaliu:劇我所知，這個dye很會卡顏色～分光測的話，記得要先用酒精 07/31 00:33
16F：→ yaliu:洗再水洗～然後取樣時，要吸排幾次再取重複性會較高 07/31 00:35
17F：→ yaliu:還有有些溶液不好取，要慢慢吸才不會取不夠喔 07/31 00:36
18F：推 antarestar:液面取 液面放! 07/31 14:41
19F：→ Doraemon7817:to yaliu:沒錯!是BioRad protein assay dye!!!96孔盤 07/31 18:48
20F：→ Doraemon7817:嗚哇0.995的目標似乎離我好遠= =我會加油的!謝謝各位 07/31 18:49
21F：推 gunking:pipetman沒定期校正? 07/31 19:13
22F：推 boblu:沒校正也應該不會每次吸放都差很多 除非氣密有損壞 08/01 00:30
23F：→ shenhsu:是用dye呈色定量的話 還會有每個well反應時間不一樣的問題 08/01 19:01
24F：推 yaliu:你的0.995會不會是到後來可能顏色太深所以偏掉？ 08/02 01:40
25F：→ yaliu:另外你同個樣品間的重複性如何？ 08/02 01:41
26F：推 leoblack:96well測之前有沒有輕拍plate使其搖勻?有沒有去泡泡!? 08/02 09:11
27F：推 birdddd:我們老闆是要求我們進實驗室第一個月要練PIPET 吸水在微量 08/07 21:42
28F：→ birdddd:天平上操作 接下來是練吸光值 R值很穩定都是0.99才可以做 08/07 21:43
29F：→ birdddd:其他實驗 雖然一開始很苦 但是沒有這樣練技術不會好 08/07 21:43
30F：→ Doraemon7817:在微量天秤沒問題...我想我可能是對那種黏滯性液體有 08/09 00:07
31F：→ Doraemon7817:障礙吧= =上次又重做時，我的STANDARD還是很不準= = 08/09 00:13
32F：→ Doraemon7817:但樣品重複還OK，所以我想可能是我加BSA或BIO-RAD那 08/09 00:14
33F：→ Doraemon7817:有甚麼問題吧...加DYE下去不要PIPETING會比較好嗎? 08/09 00:16