作者Doraemon7817 (乐在学习)
看板Biotech
标题[求救] 蛋白质浓度测不准...pipetman操作问题?
时间Sat Jul 30 03:54:19 2011
大家好，第一次在这里发文请多指教> <
我是今年的硕一新生，最近在实验室里学习跑western
再跑之前有先去测蛋白质浓度，但测出来发现
我的standard做得非常不准...我的R值只有0.95.....(学长说要0.99才够准)
但我在操作的过程中都有学长在旁检视、提点，所以应该是没有加错东西
再讨论过後推测可能是我的pipetman操作不当，量取不精准所致...
固定protein浓度後去跑胶，结果今天压片出来，我的两条band竟然差了快两倍!!!
(一样浓度应该要一样粗啊> <)所以是我真的加得很不准= =a
可是我并非第一次接触pipetman啊~大学时期曾待过实验室一年
(不过以前实验并没有要求非常精准，所以可能问题一直存在只是我现在才发现= =)
也知道pipetman有两段，第一段吸、第二段放...
我有先稍微爬了一下文，去看pipetman的操作
再由低转到高时也会转超过才转至我要的值
跟学长姐讨论後，他们说因素太多了，有可能是我吸放的速度太快
或是让protein残留在tip上过多...等，不过因为他们都没有这样的状况
所以也不知道究竟问题在哪...(只有我有这样的问题...我的手在搞甚麽啊QQ...)
目前是叫我就继续多练习找找手感
不过我希望能降低失败次数不要浪费前辈们的时间及老师的金钱> <
所以想请教各位(有人遇过这情形吗T^T)在加东西的时候该怎麽加比较准确?
是先加在管壁上然後再离心?
还是要稍微碰到液面加?
亦或是要悬空加??
然後吸跟放的速度都是要慢一点???(不过我有时慢放又会有一点点液体倒吸回tip上ˊˋ)
我的问题好笨喔ˊˋ但还是恳请大家提供一点心得或意见...
感激不尽
谢谢: )
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 220.134.145.35
1F：推 even2300471:吸放都要慢 特别是较黏溶液 07/30 12:08
2F：→ even2300471:放的时候tip在液面下按到底 抽出 07/30 12:08
3F：→ even2300471:来再放开就可避免倒吸 07/30 12:09
4F：推 shenhsu:上次有sales建议 要先吸放个3-5次 让tip管壁上先有液体 07/30 13:08
5F：→ shenhsu:之後排掉重吸才准 因为管壁上很多细小不平的痕迹会卡液体 07/30 13:10
6F：→ shenhsu:另外个人比较偏向加到液体里 加管壁上感觉就会有部分残留 07/30 13:12
7F：→ gryou:用水多练习找手感 可以顺便称重观察 07/30 15:28
8F：→ Doraemon7817:谢谢大家~我会试试，下星期会再测一次浓度，到时就 07/30 21:00
9F：→ Doraemon7817:可以知道成果了@@真紧张~ 07/30 21:01
10F：推 iyogirl:我是在液面上吐出一点小水珠让它跟液面连接缓慢吐完液体 07/30 22:19
11F：→ iyogirl:不要让tip与液体接触 我也是95被操到99的 加油喔! 07/30 22:21
12F：推 cronos:个人觉得吸放3-5次很关键 话说以前lab的标准是0.995(远目 07/30 22:26
13F：→ cronos:不要太紧张 做实验前先"冥想"每一个步骤 忌手忙脚乱XD 07/30 22:27
14F：推 yaliu:是用BioRad protein assay dye?用分光光度计测还是96well盘? 07/31 00:31
15F：→ yaliu:剧我所知，这个dye很会卡颜色～分光测的话，记得要先用酒精 07/31 00:33
16F：→ yaliu:洗再水洗～然後取样时，要吸排几次再取重复性会较高 07/31 00:35
17F：→ yaliu:还有有些溶液不好取，要慢慢吸才不会取不够喔 07/31 00:36
18F：推 antarestar:液面取 液面放! 07/31 14:41
19F：→ Doraemon7817:to yaliu:没错!是BioRad protein assay dye!!!96孔盘 07/31 18:48
20F：→ Doraemon7817:呜哇0.995的目标似乎离我好远= =我会加油的!谢谢各位 07/31 18:49
21F：推 gunking:pipetman没定期校正? 07/31 19:13
22F：推 boblu:没校正也应该不会每次吸放都差很多 除非气密有损坏 08/01 00:30
23F：→ shenhsu:是用dye呈色定量的话 还会有每个well反应时间不一样的问题 08/01 19:01
24F：推 yaliu:你的0.995会不会是到後来可能颜色太深所以偏掉？ 08/02 01:40
25F：→ yaliu:另外你同个样品间的重复性如何？ 08/02 01:41
26F：推 leoblack:96well测之前有没有轻拍plate使其摇匀?有没有去泡泡!? 08/02 09:11
27F：推 birdddd:我们老板是要求我们进实验室第一个月要练PIPET 吸水在微量 08/07 21:42
28F：→ birdddd:天平上操作 接下来是练吸光值 R值很稳定都是0.99才可以做 08/07 21:43
29F：→ birdddd:其他实验 虽然一开始很苦 但是没有这样练技术不会好 08/07 21:43
30F：→ Doraemon7817:在微量天秤没问题...我想我可能是对那种黏滞性液体有 08/09 00:07
31F：→ Doraemon7817:障碍吧= =上次又重做时，我的STANDARD还是很不准= = 08/09 00:13
32F：→ Doraemon7817:但样品重复还OK，所以我想可能是我加BSA或BIO-RAD那 08/09 00:14
33F：→ Doraemon7817:有甚麽问题吧...加DYE下去不要PIPETING会比较好吗? 08/09 00:16