作者sunday30430 (koalawoman)
看板Biotech
標題[求救] in vitro transcription 做不出來
時間Wed Jul 27 10:31:42 2011
因為實驗的需要，我是用RNAII promotor 的PCR片段當template，promotor下游還有接
100bp序列。標定的系統是用roche-DIG，in vitro transcription完後做northern，沒
有hybridization 直接壓片。
5x transcription buffer (paper上寫的)
STOCK WORK
Tris-Hcl 0.2M 40
KCl 0.75M 10
MgCl 50mM 160
glycerol 5% 1%
DTT 2mM 0.4
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reaction
template(60.4ng/ul) 3ul
5xtranscription buffer 4ul
DIG-NTP MIX(10mM) 2ul
RNA polymerase(0.7ug/ul) 2ul
RNAse inhibitor(40U/ul) 2ul
DEPC-H2O 7.3ul
↓37度，兩小時
加入 2ul 0.2M EDTA 終止反應
20ul loading dye
loading dye(roche的配方)
250 ul of 100% Formamide
83ul of 37% Formaldehyde
50 ul 10 × MOPS
50 ul 100% Glycerol
10 ul 2.5% Bromphenolblue
57 ul DEPC/DMPC treated water
↓65度，10min
↓冰上 2min
↓run 1.5% Formaldehyd
2.25 g Agarose
141.9 ml 1 × MOPS
8.1 ml 37% Formaldehyde
running buffer:1X MOPS
↓50V，兩個小時
transfer overnight→detect →壓片
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我在跑膠的時候有loading control RNA，壓片有壓出來，可是我的sample一片空白，
表示我跑膠之後的方法是沒錯的，所以是出在我的sample根本沒有轉出RNA吧!?
麻煩大家幫我看看是怎麼回事啊~~~~~~~~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.94.172
※ 編輯: sunday30430 來自: 163.25.118.160 (07/27 18:56)
1F：→ prodsupt:template只有180 ng? 會不會太低，要label的話我的經驗是 08/01 09:04
2F：→ prodsupt:產量會比較低，你們實驗室其他人有相同問題嗎? 08/01 09:05
3F：→ sunday30430:我們實驗室沒有人做過，對我們來說是一個新實驗， 08/01 14:52
4F：→ sunday30430:TEMPLATE我今天有再放大，會再做一個1ug的! 08/01 14:53
5F：→ sunday30430:有再重新泡buffer,DEPC treat後滅菌兩次，時間縮短成 08/01 16:49
6F：→ sunday30430:1小時! 08/01 16:49
7F：→ prodsupt:請考慮用kit做，一組大約1~1.3萬，Ambion有一組做短片段 08/01 23:24
8F：→ prodsupt:或先download package insert參考看看要怎麼試條件 08/01 23:27
9F：→ prodsupt:痾，kit不適用... 08/02 00:24
10F：→ sunday30430:kit都不是用E.coli自己的promotor,所以kit都不適用! 08/02 14:08