作者sunday30430 (koalawoman)
看板Biotech
标题[求救] in vitro transcription 做不出来
时间Wed Jul 27 10:31:42 2011
因为实验的需要，我是用RNAII promotor 的PCR片段当template，promotor下游还有接
100bp序列。标定的系统是用roche-DIG，in vitro transcription完後做northern，没
有hybridization 直接压片。
5x transcription buffer (paper上写的)
STOCK WORK
Tris-Hcl 0.2M 40
KCl 0.75M 10
MgCl 50mM 160
glycerol 5% 1%
DTT 2mM 0.4
----------------------------------------------
reaction
template(60.4ng/ul) 3ul
5xtranscription buffer 4ul
DIG-NTP MIX(10mM) 2ul
RNA polymerase(0.7ug/ul) 2ul
RNAse inhibitor(40U/ul) 2ul
DEPC-H2O 7.3ul
↓37度，两小时
加入 2ul 0.2M EDTA 终止反应
20ul loading dye
loading dye(roche的配方)
250 ul of 100% Formamide
83ul of 37% Formaldehyde
50 ul 10 × MOPS
50 ul 100% Glycerol
10 ul 2.5% Bromphenolblue
57 ul DEPC/DMPC treated water
↓65度，10min
↓冰上 2min
↓run 1.5% Formaldehyd
2.25 g Agarose
141.9 ml 1 × MOPS
8.1 ml 37% Formaldehyde
running buffer:1X MOPS
↓50V，两个小时
transfer overnight→detect →压片
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我在跑胶的时候有loading control RNA，压片有压出来，可是我的sample一片空白，
表示我跑胶之後的方法是没错的，所以是出在我的sample根本没有转出RNA吧!?
麻烦大家帮我看看是怎麽回事啊~~~~~~~~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.94.172
※ 编辑: sunday30430 来自: 163.25.118.160 (07/27 18:56)
1F：→ prodsupt:template只有180 ng? 会不会太低，要label的话我的经验是 08/01 09:04
2F：→ prodsupt:产量会比较低，你们实验室其他人有相同问题吗? 08/01 09:05
3F：→ sunday30430:我们实验室没有人做过，对我们来说是一个新实验， 08/01 14:52
4F：→ sunday30430:TEMPLATE我今天有再放大，会再做一个1ug的! 08/01 14:53
5F：→ sunday30430:有再重新泡buffer,DEPC treat後灭菌两次，时间缩短成 08/01 16:49
6F：→ sunday30430:1小时! 08/01 16:49
7F：→ prodsupt:请考虑用kit做，一组大约1~1.3万，Ambion有一组做短片段 08/01 23:24
8F：→ prodsupt:或先download package insert参考看看要怎麽试条件 08/01 23:27
9F：→ prodsupt:痾，kit不适用... 08/02 00:24
10F：→ sunday30430:kit都不是用E.coli自己的promotor,所以kit都不适用! 08/02 14:08