作者Realthugz (平安夜 失身夜)
看板Biotech
標題[求救] 抽miniprep還可以 養來抽maxi就不見了
時間Wed Jul 6 23:18:51 2011
材料:
DH5a competent cell (commercial)
pLV hPGKGFP EFS-HA lentiviral plasmid, ~10Kb
Terrific Broth +Amp 100ug/ml
方法:
1. plasmid ransform E.coli overnight,37度約14hr
2. 收盤後挑clone養2ml TB+Amp, 200rpm, 37度約14hr
3. 收菌, phenol check, 抽mini RE check
4. 200ul菌液加到100ml TB+Amp, 錐形瓶shake 200rpm, 37度約14-16hr
5. 收菌, phenol check, miniprep. 問題出現了.
觀察與問題:
1. 只要是這支vector plasmid長的colony都非常小顆
2. 抽mini的結果不太穩定, Nanodrop的圖沒異常但讀值不準, 260/280都落在1.9
拿去跑EtBr膠後product乾淨但跟讀值很明顯對不起來,
yield跟其他plasmid比差蠻多的。
3. 菌在TB或LB都長得很好, 小量抽起來還足以應付實驗但拿去養大量後幾乎沒有yield
心得:
1. 拿到plasmid時學長就有說這plasmid比較難搞, 繼代後表現很差
(學長表示這無法凍起來當stock,我想是否也表示養大量效果很差?)
2. mini成功率較高我認為是因為clone夠fresh
3. 這支plasmid我已經用很久了但因為mini就足夠實驗需求所以還好
4. 沒map, 是跟別人要的別人沒畫圖, backbone是pLV,網路查到的都是high copy number
5. 網路上剛看到討論, plasmid/GOI如對E.coli有影響,colony會很小,
即使promoter是Euk.也很難說.可能的解決方法是做實驗菌要fresh,
Amp不要太濃25-50ug/ml, transform時DNA用少量(<1ng,pg等級)等等
6. 本人+博6學長mini, midi, maxi都頗有經驗,
抽過大大小小plasmid很多,就這隻很奇怪。
7. 試過一些冷門方法, 比如加chloramphrenicol, 徒勞無功, 最近會再試其他想法
因為最近要做天殺的electroporation 光用mini做實驗會很拮据
希望大家能給我些意見... 延畢後期這節骨眼可以的話我很不想換vector...
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有悟性的人，就讓他計算天團的數字，
因為這是神的數字，它的數字是
五千
五百
六十
六。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.55.238
1F：推 aceliang:要馬用Stbl3做，要馬就多挑些colony，養大量時多加點 07/06 23:56
2F：→ aceliang:pre-incubated菌液。pLV跟pHR系列都殘障殘障的。 07/06 23:57
3F：→ aceliang:至於chloramphenicol...，這不是另一種抗生素嘛 @"@ 07/06 23:58
沒錯, 藥理上是抑制peptide生成 但也常用來提高low copy plasmid的產量
我記得Molecular Cloning有寫 只是應該很少人需要用吧 哈
4F：→ blence:步驟3~4之間,你200ul菌液應該不是fresh,是放著等mini ok? 07/07 00:06
我也試過不等先馬上丟去養大量 再check確認丟下去的有Plasmid 但養出來救試沒有
而且我想相對其他步驟的時間 那mini的時間不怎麼影響freshness
5F：→ rudis:in stead of Amp, try carbenicillin, which is more stable 07/07 10:50
謝謝大家的意見
這期間我才知道不只我在lentiviral plasmid上碰到這問題
還看到別人的問題有 LTR 跟 recombination 真的很詭異
(目前的菌號稱幾乎沒有recombination, 因為recA deletion etc.)
尤其ace大提的stbl strain 我才知道有專門針對這個的E coli...
※ 編輯: Realthugz 來自: 140.109.55.238 (07/07 17:15)
6F：→ blence:兩個方法,1.直挑數顆midi, o/n凍pellet,先取1cc mini test 07/08 00:38
7F：→ blence:或2.將溫度一律改成30度,check mini同時丟100ul到100ml o/n 07/08 00:40
8F：→ blence:我有顆帶有9kb基因的vector,國外lab給的建議就是用30度,不 07/08 00:42
9F：→ blence:然,連circular的塗盤也永遠挑不出正確的 07/08 00:44
10F：→ blence:也有4.5kb基因的,只要是o/n後mini剩下的,再去o/n都掉光光 07/08 00:48
11F：→ blence:最後才知有些construct就是這麼麻煩,每次都要先mini check 07/08 00:53
12F：→ untilnow:stb1＋1 07/08 20:41