作者Realthugz (平安夜 失身夜)
看板Biotech
标题[求救] 抽miniprep还可以 养来抽maxi就不见了
时间Wed Jul 6 23:18:51 2011
材料:
DH5a competent cell (commercial)
pLV hPGKGFP EFS-HA lentiviral plasmid, ~10Kb
Terrific Broth +Amp 100ug/ml
方法:
1. plasmid ransform E.coli overnight,37度约14hr
2. 收盘後挑clone养2ml TB+Amp, 200rpm, 37度约14hr
3. 收菌, phenol check, 抽mini RE check
4. 200ul菌液加到100ml TB+Amp, 锥形瓶shake 200rpm, 37度约14-16hr
5. 收菌, phenol check, miniprep. 问题出现了.
观察与问题:
1. 只要是这支vector plasmid长的colony都非常小颗
2. 抽mini的结果不太稳定, Nanodrop的图没异常但读值不准, 260/280都落在1.9
拿去跑EtBr胶後product乾净但跟读值很明显对不起来,
yield跟其他plasmid比差蛮多的。
3. 菌在TB或LB都长得很好, 小量抽起来还足以应付实验但拿去养大量後几乎没有yield
心得:
1. 拿到plasmid时学长就有说这plasmid比较难搞, 继代後表现很差
(学长表示这无法冻起来当stock,我想是否也表示养大量效果很差?)
2. mini成功率较高我认为是因为clone够fresh
3. 这支plasmid我已经用很久了但因为mini就足够实验需求所以还好
4. 没map, 是跟别人要的别人没画图, backbone是pLV,网路查到的都是high copy number
5. 网路上刚看到讨论, plasmid/GOI如对E.coli有影响,colony会很小,
即使promoter是Euk.也很难说.可能的解决方法是做实验菌要fresh,
Amp不要太浓25-50ug/ml, transform时DNA用少量(<1ng,pg等级)等等
6. 本人+博6学长mini, midi, maxi都颇有经验,
抽过大大小小plasmid很多,就这只很奇怪。
7. 试过一些冷门方法, 比如加chloramphrenicol, 徒劳无功, 最近会再试其他想法
因为最近要做天杀的electroporation 光用mini做实验会很拮据
希望大家能给我些意见... 延毕後期这节骨眼可以的话我很不想换vector...
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有悟性的人，就让他计算天团的数字，
因为这是神的数字，它的数字是
五千
五百
六十
六。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.55.238
1F：推 aceliang:要马用Stbl3做，要马就多挑些colony，养大量时多加点 07/06 23:56
2F：→ aceliang:pre-incubated菌液。pLV跟pHR系列都残障残障的。 07/06 23:57
3F：→ aceliang:至於chloramphenicol...，这不是另一种抗生素嘛 @"@ 07/06 23:58
没错, 药理上是抑制peptide生成 但也常用来提高low copy plasmid的产量
我记得Molecular Cloning有写 只是应该很少人需要用吧 哈
4F：→ blence:步骤3~4之间,你200ul菌液应该不是fresh,是放着等mini ok? 07/07 00:06
我也试过不等先马上丢去养大量 再check确认丢下去的有Plasmid 但养出来救试没有
而且我想相对其他步骤的时间 那mini的时间不怎麽影响freshness
5F：→ rudis:in stead of Amp, try carbenicillin, which is more stable 07/07 10:50
谢谢大家的意见
这期间我才知道不只我在lentiviral plasmid上碰到这问题
还看到别人的问题有 LTR 跟 recombination 真的很诡异
(目前的菌号称几乎没有recombination, 因为recA deletion etc.)
尤其ace大提的stbl strain 我才知道有专门针对这个的E coli...
※ 编辑: Realthugz 来自: 140.109.55.238 (07/07 17:15)
6F：→ blence:两个方法,1.直挑数颗midi, o/n冻pellet,先取1cc mini test 07/08 00:38
7F：→ blence:或2.将温度一律改成30度,check mini同时丢100ul到100ml o/n 07/08 00:40
8F：→ blence:我有颗带有9kb基因的vector,国外lab给的建议就是用30度,不 07/08 00:42
9F：→ blence:然,连circular的涂盘也永远挑不出正确的 07/08 00:44
10F：→ blence:也有4.5kb基因的,只要是o/n後mini剩下的,再去o/n都掉光光 07/08 00:48
11F：→ blence:最後才知有些construct就是这麽麻烦,每次都要先mini check 07/08 00:53
12F：→ untilnow:stb1＋1 07/08 20:41