作者bu105330 (停止流動的心)
看板Biotech
標題[求救] Lentivirus infection效果...
時間Mon Jun 27 02:47:55 2011
目前我使用跟附近實驗室拿的pLenti4-CPO2 plasmid想要
overexpression 我的蛋白，另外則是用中研院的pMDG& delta 8.91
6 well 比例3:0.3(pMDG):2.7(8.91) :Lipo2000(12ul) 6hr changer medium
48&72hr後都各收一次soup infection時有+ploybrene&離心2500rpm 30mins
24hr後重新infect 一次 在24hr後換10%FBS讓他長。
另外我也有產eGFP Virus(同lenti4 Backbone)來當control
結果我有用螢光去觀察eGFP表現其實都有表現但是亮度都不強
我用western去偵測我目標蛋白也是偵測不到，但是我用HA可以偵測到(我Plasmid有掛HA)
目前已經排除是Ab問題(我transfect 可以偵測到)。時間點已經收到96hr了..
請問各位學長們有沒有什麼建議好讓我增加titer...快不能畢業了orz
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.64.30
1F：推 Realthugz:病毒可以高速離心濃縮 => 救你現在的supernatant 06/27 05:29
2F：→ Realthugz:長久之計就是... 從transfect開始optimize你的protocol 06/27 05:29
3F：→ Realthugz:如果都OK 那可能就要換shuttle vector或接強的promoter 06/27 05:31
4F：推 Realthugz:亮度不強是跟誰比? transient transfection? 06/27 05:33
5F：→ bu105330:嗯回樓上是用同種GFP virus infect 293T比 06/27 08:42
6F：→ bu105330:有什麼建議optimize protocol嗎@@ 06/27 08:43
7F：→ soom:跟原實驗室拿他們的package plasmid跟protocol 06/27 12:53
8F：推 icome:用低代數的細胞 會有差 cDNA表現的病毒蠻難做的 我也搞很久 06/28 06:57
9F：→ icome:titer都會比shRNA的低很多 只能用離心濃縮提高titer 06/28 06:59
10F：→ bu105330:離心濃縮 不是要買kit? 06/28 12:48
11F：推 aggaci:peg即可 06/28 15:51
12F：→ bu105330:小弟不才 啥是peg@@" 06/28 16:19
13F：推 williamyang:可以google "PEG6000"看看 06/28 16:58
14F：→ bu105330:嗯有查到了...但是網路上的做法都很模糊XD 06/28 17:50
15F：→ bu105330:有人可以分享一下濃縮的流程嗎@@" 06/28 17:50
16F：推 Realthugz:293T養到morphology怪怪的就不要用了 會影響titer 06/28 21:22
17F：→ aggaci:給我信箱 我寄給你protocol.. 06/28 21:54
18F：推 williamyang:我是用20000rpm,4度C,2小時濃縮的. 06/29 13:21