作者bu105330 (停止流动的心)
看板Biotech
标题[求救] Lentivirus infection效果...
时间Mon Jun 27 02:47:55 2011
目前我使用跟附近实验室拿的pLenti4-CPO2 plasmid想要
overexpression 我的蛋白，另外则是用中研院的pMDG& delta 8.91
6 well 比例3:0.3(pMDG):2.7(8.91) :Lipo2000(12ul) 6hr changer medium
48&72hr後都各收一次soup infection时有+ploybrene&离心2500rpm 30mins
24hr後重新infect 一次 在24hr後换10%FBS让他长。
另外我也有产eGFP Virus(同lenti4 Backbone)来当control
结果我有用萤光去观察eGFP表现其实都有表现但是亮度都不强
我用western去侦测我目标蛋白也是侦测不到，但是我用HA可以侦测到(我Plasmid有挂HA)
目前已经排除是Ab问题(我transfect 可以侦测到)。时间点已经收到96hr了..
请问各位学长们有没有什麽建议好让我增加titer...快不能毕业了orz
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.64.30
1F：推 Realthugz:病毒可以高速离心浓缩 => 救你现在的supernatant 06/27 05:29
2F：→ Realthugz:长久之计就是... 从transfect开始optimize你的protocol 06/27 05:29
3F：→ Realthugz:如果都OK 那可能就要换shuttle vector或接强的promoter 06/27 05:31
4F：推 Realthugz:亮度不强是跟谁比? transient transfection? 06/27 05:33
5F：→ bu105330:嗯回楼上是用同种GFP virus infect 293T比 06/27 08:42
6F：→ bu105330:有什麽建议optimize protocol吗@@ 06/27 08:43
7F：→ soom:跟原实验室拿他们的package plasmid跟protocol 06/27 12:53
8F：推 icome:用低代数的细胞 会有差 cDNA表现的病毒蛮难做的 我也搞很久 06/28 06:57
9F：→ icome:titer都会比shRNA的低很多 只能用离心浓缩提高titer 06/28 06:59
10F：→ bu105330:离心浓缩 不是要买kit? 06/28 12:48
11F：推 aggaci:peg即可 06/28 15:51
12F：→ bu105330:小弟不才 啥是peg@@" 06/28 16:19
13F：推 williamyang:可以google "PEG6000"看看 06/28 16:58
14F：→ bu105330:嗯有查到了...但是网路上的做法都很模糊XD 06/28 17:50
15F：→ bu105330:有人可以分享一下浓缩的流程吗@@" 06/28 17:50
16F：推 Realthugz:293T养到morphology怪怪的就不要用了 会影响titer 06/28 21:22
17F：→ aggaci:给我信箱 我寄给你protocol.. 06/28 21:54
18F：推 williamyang:我是用20000rpm,4度C,2小时浓缩的. 06/29 13:21