作者cewdw (幹你媽的鬼鬼)
看板Biotech
標題[求救] reverse genetics做flu virus
時間Wed Jun 22 15:08:32 2011
我用的方式為
以Opti-MEM稀釋lipofectamine(92:8) 5分鐘
再以Opti-MEM稀釋8ug plasmid到總量100ul
混合20分鐘以上最晚到半小時後即加入6well中的MDCK+293T的co-culture
(各7.5*10^5)
此時的medium並沒有antibiotics
隔天換infectious medium
再隔天把supernatant收下取500ul到10cm dish中八分滿的MDCK去amplify
但是量似乎一直很少
甚至似乎沒有
以plaque assay定量總是沒有點出來
有沒有高手可以幫忙一下
感謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.130.155
1F：→ jimmyshen17:同IP推一下XD 06/22 21:09
2F：→ cewdw:樓上克隆王 06/23 00:18
3F：推 ericial:你用的SYSTEM是12 PLASMID 還是8的? 06/23 12:39
4F：→ cewdw:8的 06/23 14:10
5F：推 ericial:MDCK和293的比例可能要調一下 書上雖然是這樣寫 06/23 22:33
6F：→ ericial:但是MDCK會很強勢的生長把293T鏟起來 特別你的細胞又一樣 06/23 22:34
7F：→ ericial:而且八個的不像12個的有四個RNP expression plasmid 06/23 22:34
8F：→ ericial:八個都是POL1-POL2 system的 會比較慢產生病毒 06/23 22:35
9F：→ ericial:可以試試看用10CM DISH去transfect 然後plasmid用多一點 06/23 22:37
10F：→ ericial:我之前也TRY了很多次條件後來titer才出來 06/23 22:38
11F：→ cewdw:所以MDCK有可能阻礙293T導致我transfect的效果失效嗎 06/24 12:58
12F：→ cewdw:感覺12 plasmid的效率比較好? 06/24 12:59
13F：推 ericial:12 plasmid system的效果比較好 06/28 12:02