作者cewdw (干你妈的鬼鬼)
看板Biotech
标题[求救] reverse genetics做flu virus
时间Wed Jun 22 15:08:32 2011
我用的方式为
以Opti-MEM稀释lipofectamine(92:8) 5分钟
再以Opti-MEM稀释8ug plasmid到总量100ul
混合20分钟以上最晚到半小时後即加入6well中的MDCK+293T的co-culture
(各7.5*10^5)
此时的medium并没有antibiotics
隔天换infectious medium
再隔天把supernatant收下取500ul到10cm dish中八分满的MDCK去amplify
但是量似乎一直很少
甚至似乎没有
以plaque assay定量总是没有点出来
有没有高手可以帮忙一下
感谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.130.155
1F：→ jimmyshen17:同IP推一下XD 06/22 21:09
2F：→ cewdw:楼上克隆王 06/23 00:18
3F：推 ericial:你用的SYSTEM是12 PLASMID 还是8的? 06/23 12:39
4F：→ cewdw:8的 06/23 14:10
5F：推 ericial:MDCK和293的比例可能要调一下 书上虽然是这样写 06/23 22:33
6F：→ ericial:但是MDCK会很强势的生长把293T铲起来 特别你的细胞又一样 06/23 22:34
7F：→ ericial:而且八个的不像12个的有四个RNP expression plasmid 06/23 22:34
8F：→ ericial:八个都是POL1-POL2 system的 会比较慢产生病毒 06/23 22:35
9F：→ ericial:可以试试看用10CM DISH去transfect 然後plasmid用多一点 06/23 22:37
10F：→ ericial:我之前也TRY了很多次条件後来titer才出来 06/23 22:38
11F：→ cewdw:所以MDCK有可能阻碍293T导致我transfect的效果失效吗 06/24 12:58
12F：→ cewdw:感觉12 plasmid的效率比较好? 06/24 12:59
13F：推 ericial:12 plasmid system的效果比较好 06/28 12:02