※ 引述《starjim (Jim)》之銘言： : PCR完跑膠 : 但是卡在internal control一直不equal : 導致一直無法繼續往下做 : 我用的internal control是beta-actin : 已經重新跑過幾次PCR了 : 甚至連RT都重做了 : 可是就是一直卡在某個lane比較weak : 每次跑完就是那個lane比weak : 甚至我還把PCR完的product拿去用nanodrop測DNA濃度 : 結果是每管的濃度都差不多 分享我的經驗，如果和大家的見解不同，希望大家和我一起多討論! 關於測濃度這件事 在PCR完後，轉cDNA後 測的濃度包含了樣本中的dNTP/rNTP、用剩的primer和solvent中其他的物質 這些在OD260都會吸收的! 所以沒辦法反應出真正的PCR product量 要測的話 要先做完clean-up(酒精沉澱或用kit)再測才是準的 : 我已經想不到有什麼方法可以解決這問題了 : 請問板上的高手有什麼其他的方法嗎? : 謝謝~~ 關於internal control equal這個要求， 我覺得樣本處理的很重要， 我的經驗是，每一管的組織/樣本量一定要固定， 固體組織類的要確實秤量， 例如葉子等的要確實吸乾表面上的水再秤， 細菌的定量，一定要確實用pippet弄散測完OD，再取菌液做實驗 還有如果是微量核酸樣本的話(像血清中的病毒)， 要加入carrier RNA/DNA (>3ug)後再純化，才能確保純化過程中每一管的效率相等， 另外如果要做RT，RNA純化的最後一步要用DNase處理， ELUTION完成後再以OD260的值來normalize，確保拿去做RT的RNA量相同， (有些方法或kit不保證能移除PRIMER，這時不適用) 然後在配PREIX時，我建議在分裝PREMIX時，每一管都要用新的TIP， 因為有些TIPA體沾黏，這樣通常會造成最後幾管的值怪怪的， --

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