作者spy1015 ()
看板Biotech
標題[求救] 要怎麼cloning最快
時間Thu Jun 16 22:06:47 2011
想請問各位，作cloning時拿去定序後
發現選出來insert gene有些地方序列有錯
請問你們會整個再從pcr開始，重新ligation
還是把上次ligation剩下的再重新transform呢？
我都挑不到全對的序列，已經用pfu dna polymerase了！
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◆ From: 140.112.234.242
1F：推 Realthugz:如果有人告訴你的話 請你也告訴我 Orz 06/16 22:15
2F：推 aceliang:搞不好template就錯了阿= = 06/16 22:26
3F：推 Duckhunter:其實在等答案的這兩天，就又再重新做完一次了 06/16 22:38
4F：→ spirithorse:PCR cycle數多少啊?? 小於25 cycles做看看 06/16 22:47
5F：→ spy1015:35cycle.......是減少chycle數減少erro rate嗎 06/16 22:48
6F：推 williamyang:mutagenesis回正確的sequence 06/16 23:17
7F：→ mzac1b:我覺得直接用之前的去transform 挑菌後 多挑幾顆去定序 06/17 06:41
8F：→ mzac1b:但真要說快的話 就是每種方法同時嘗試直到做出來為止 XD 06/17 06:45
9F：→ shenhsu:如果重弄template還是錯一樣地方，有可能是物種差異而跟da 06/17 14:06
10F：→ jimmyshen17:基本上PCR要出錯得機率不高~ 06/21 21:50
11F：→ jimmyshen17:跑完PCR有用gel extraction純化你的insert嗎?? 06/21 21:51
12F：→ jimmyshen17:再來所謂挑不到全對的序列~指的是那種錯誤?? 06/21 21:52
13F：→ jimmyshen17:是point mutation還是有deletion??還是序列全錯?? 06/21 21:53
14F：→ jimmyshen17:如果是point mutantion就請多挑幾顆去訂序 06/21 21:54
15F：→ jimmyshen17:如果是delection或是insertion奇怪的序列~~ 06/21 21:55
16F：→ jimmyshen17:請檢查你的primer是否黏到錯的地方 06/21 21:55
17F：→ jimmyshen17:如果訂序結果全部都不對...那應該contaminate了!! 06/21 21:56
18F：→ jimmyshen17:對了~訂序結果不是還會附一張訊號圖!! 06/21 22:06
19F：→ jimmyshen17:看看訊號有沒有很雜亂~~那也是判斷之一!! 06/21 22:07