作者spy1015 ()
看板Biotech
标题[求救] 要怎麽cloning最快
时间Thu Jun 16 22:06:47 2011
想请问各位，作cloning时拿去定序後
发现选出来insert gene有些地方序列有错
请问你们会整个再从pcr开始，重新ligation
还是把上次ligation剩下的再重新transform呢？
我都挑不到全对的序列，已经用pfu dna polymerase了！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.234.242
1F：推 Realthugz:如果有人告诉你的话 请你也告诉我 Orz 06/16 22:15
2F：推 aceliang:搞不好template就错了阿= = 06/16 22:26
3F：推 Duckhunter:其实在等答案的这两天，就又再重新做完一次了 06/16 22:38
4F：→ spirithorse:PCR cycle数多少啊?? 小於25 cycles做看看 06/16 22:47
5F：→ spy1015:35cycle.......是减少chycle数减少erro rate吗 06/16 22:48
6F：推 williamyang:mutagenesis回正确的sequence 06/16 23:17
7F：→ mzac1b:我觉得直接用之前的去transform 挑菌後 多挑几颗去定序 06/17 06:41
8F：→ mzac1b:但真要说快的话 就是每种方法同时尝试直到做出来为止 XD 06/17 06:45
9F：→ shenhsu:如果重弄template还是错一样地方，有可能是物种差异而跟da 06/17 14:06
10F：→ jimmyshen17:基本上PCR要出错得机率不高~ 06/21 21:50
11F：→ jimmyshen17:跑完PCR有用gel extraction纯化你的insert吗?? 06/21 21:51
12F：→ jimmyshen17:再来所谓挑不到全对的序列~指的是那种错误?? 06/21 21:52
13F：→ jimmyshen17:是point mutation还是有deletion??还是序列全错?? 06/21 21:53
14F：→ jimmyshen17:如果是point mutantion就请多挑几颗去订序 06/21 21:54
15F：→ jimmyshen17:如果是delection或是insertion奇怪的序列~~ 06/21 21:55
16F：→ jimmyshen17:请检查你的primer是否黏到错的地方 06/21 21:55
17F：→ jimmyshen17:如果订序结果全部都不对...那应该contaminate了!! 06/21 21:56
18F：→ jimmyshen17:对了~订序结果不是还会附一张讯号图!! 06/21 22:06
19F：→ jimmyshen17:看看讯号有没有很杂乱~~那也是判断之一!! 06/21 22:07