作者starjim (Jim)
看板Biotech
標題[求救] PCR 跑膠internal control一直不equal
時間Thu Jun 16 20:46:40 2011
PCR完跑膠
但是卡在internal control一直不equal
導致一直無法繼續往下做
我用的internal control是beta-actin
已經重新跑過幾次PCR了
甚至連RT都重做了
可是就是一直卡在某個lane比較weak
每次跑完就是那個lane比weak
甚至我還把PCR完的product拿去用nanodrop測DNA濃度
結果是每管的濃度都差不多
我已經想不到有什麼方法可以解決這問題了
請問板上的高手有什麼其他的方法嗎?
謝謝~~
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◆ From: 203.71.94.31
1F：推 flyeagle1978:PCR跑完去測濃度 沒有意義 因為buffer有鹽類 會干擾 06/16 21:00
2F：→ flyeagle1978:你換GAPDH試試吧 06/16 21:01
3F：→ starjim:因為我只是想確定product濃度是不是一樣 06/16 21:03
4F：→ starjim:那測cDNA的濃度會有意義嗎?因為我也有測= = 06/16 21:04
5F：→ boblu:每一管都有鹽類 背景值應該相同吧？ 06/16 21:13
6F：→ boblu:不然 blank 可以用一管沒跑 PCR 的 mix 去做 06/16 21:13
7F：→ Realthugz:恩... 照樣可以normalize吧 可能你那特定sample的 06/16 21:26
8F：→ Realthugz:RNA quality比較差一點 06/16 21:26
9F：→ Realthugz:只要cycle數抓住 還是可以normalize吧 06/16 21:27
10F：→ Realthugz:不然就是那組的treatment造成細胞數差異 06/16 21:28
11F：→ Realthugz:根據你的敘述跟我的經驗 我也只能這樣troubleshooting 06/16 21:29
12F：→ harry:cDNA或PCR產物若未純話去測濃度差不多，只能表示你的dNTP 06/16 21:34
13F：→ harry:加的很準，你可以直接拿一點dNTP去測就知道了 06/16 21:36
14F：→ jsi:可能beta-actin不是這實驗適合的internal control,建議可多找 06/18 04:53
15F：→ jsi:找幾種常用的internal control gene做做看 06/18 04:54
16F：→ mzac1b:那就把其他lane 都弄到一樣weak 06/18 05:23
17F：→ mzac1b:不然就換GAPDH吧 06/18 05:26
18F：→ starjim:目前又做一次已經算equal了~另外我也跑了GAPDH 06/18 18:43
19F：→ starjim:只是還沒跑膠而已~謝謝各位的幫忙~~ 06/18 18:43
20F：→ Danielle:差很多嗎? 沒有差很多的話可以用image J做normalize 06/20 16:38
21F：→ Danielle:如果差到肉眼可見兩倍以上就有點多了 06/20 16:38
22F：→ starjim:我是用image J定量耶 06/20 17:47
23F：→ starjim:可是肉眼看起來差不多~但是訂了就差大約0.9倍左右 06/20 17:48
24F：→ starjim:訂了之後跑完肉眼看起來差不多 06/20 17:48