※ 引述《karas888 (爆熱武者 無雙抖抖丸 )》之銘言： : 謝謝雜碎大哥XD : 專業的講解非常清楚XD!!超級感謝 : 因為小弟非生物背景 所以還有很多問題 : 在下想問清楚!! : ※ 引述《Ianthegood (雜碎。)》之銘言： : : 同學 : : 你可能資料要再看清楚喔 : : 電泳是用來分析DNA片段大小用的 : : 如果DNA量不夠 : : 電泳的靈敏度有限 跑出來還是會看不到 : : PCR系列的技術是用來放大DNA片段用的 : : 一般都是pcr放大完再用電泳來檢視結果這樣 : : 然後你說的那個什麼熱交換 我真的不知道是什麼XD (通常是散熱器吧?) : : PCR是利用DNA在不同溫度兩股會分開與重新黏合的概念 : : 加上合成酵素適合高溫 : DNA再因為熱對流循環會造成三階段溫度 : 97度左右開始變性 52度左右黏合 74度左右擴增 : 97度會變性是因為DNA本身到這個溫度就會氫鍵裂解嗎? : 還有就是說那您在這邊提到的說到合成酵素適合的高溫 : 是指說這個熱循環需要黏合的最低溫度是由此酵素決定的嗎? DNA的長度跟其變性溫度有很大的關係 94度大概是雙股DNA裡面的氫鍵全部會打開的溫度 dsRNA或是DNA-RNA hybrid要再高幾度 五十幾度是primer黏合到template上面的溫度 primer就是人工合成用來放大所需片段用的小片段單股DNA 一般物種的genome大概都是破百萬個base pair primer一般是20到30個nucleotide之間 primer會做兩個 一左一右剛好把你要的sequence夾起來 那這個五十幾度的溫度就是primer跟template之間可以開始黏合的溫度 template自己的雙股因為太大所以沒辦法這麼快黏起來 接著上72度 這是大部分DNA polymerase最適合工作的溫度 效率最高 以基本款的taq polymerase來講大概一分鐘1K的長度 理論上也可以不要上去留在五十幾度 不過效率就會很糟 時間就要留很久 然後重複這個cycle 從primer新做好的股又會被打開變成新的template 於是就等比上去了 : 以高溫低溫的循環讓DNA產生2的N次方的放大(N=cycle數) : : 一般都是跑30+cycles 放大幾倍可以自己算一下 : : 電泳是把膠體放在溶液裡 : : DNA再放在膠體裡 : : 溶液通電之後導致大小不同的分子在膠內移動距離不同的現象 : : 定量的部份就是染色後這些分子團顯現出的亮度 : : 分子越多越亮 : : 簡單說就是這樣 : : 然後qPCR : : 就是你提到的螢光 : : 利用的是具有螢光的原料來進行PCR : : 所以在每個cycle的放大中螢光就會逐漸增強 : : 借此來達到定量的效果 : : 那為什麼不全面放棄電泳呢 : : 貴阿 : : qPCR的機器耗材軟體有的沒的 而且template的純度要求很高 : : 比起來電泳的成本跟自來水一樣(菸) : 在電泳法對分離開來的分子量做量化處理也是使用螢光染劑? : 那跟qpcr這裡的螢光染劑有什麼不同阿? : 還有就是real-time pcr 跟qPCR差在哪裡阿? : 有網友推文說差再定量方式? : 真的很好奇 : 謝謝您>"< 電泳確實是用螢光染劑沒錯 不過因為PCR是個奇妙的反應 有可能你的產物到某個濃度就不會再增加了 或是到第幾個cycle primer就用完了 因gene而異(也不一定是gene @@) 理論上你可以同時做35管同樣的反應 然後在每個cycle終止一管的反應 再全部拿去跑膠 就可以得到類似qPCR的結果 但是很累 所以才有real-time PCR 又稱quantitative PCR 或是real-time quantitative PCR的誕生 這個東西嚴格說起來並不是染劑去與DNA結合 而是它的原料本身會發光 在機器裡面反應的過程直接有個detector抓它的吸光醬 這個跟reverse transcription PCR (RT-PCR又是完全的不同) 後者為將RNA反轉錄成DNA用的 這也牽扯到qPCR的發展 因為學者們對於真正活體內RNA的量很好奇 而前面有提 經過普通的PCR無差別放大之後 你的初始量就幾乎不可能定了 因此才會有qPCR的誕生 另外還是要講一下 google很好用的 維基很多不是最尖端科技的東西資料也都很豐富 自己動手記得會比較牢阿 -- 人好 欠表 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 110.174.79.41 ※ 編輯: Ianthegood 來自: 110.174.79.41 (06/13 00:10)