※ 引述《karas888 (爆热武者 无双抖抖丸 )》之铭言： : 谢谢杂碎大哥XD : 专业的讲解非常清楚XD!!超级感谢 : 因为小弟非生物背景 所以还有很多问题 : 在下想问清楚!! : ※ 引述《Ianthegood (杂碎。)》之铭言： : : 同学 : : 你可能资料要再看清楚喔 : : 电泳是用来分析DNA片段大小用的 : : 如果DNA量不够 : : 电泳的灵敏度有限 跑出来还是会看不到 : : PCR系列的技术是用来放大DNA片段用的 : : 一般都是pcr放大完再用电泳来检视结果这样 : : 然後你说的那个什麽热交换 我真的不知道是什麽XD (通常是散热器吧?) : : PCR是利用DNA在不同温度两股会分开与重新黏合的概念 : : 加上合成酵素适合高温 : DNA再因为热对流循环会造成三阶段温度 : 97度左右开始变性 52度左右黏合 74度左右扩增 : 97度会变性是因为DNA本身到这个温度就会氢键裂解吗? : 还有就是说那您在这边提到的说到合成酵素适合的高温 : 是指说这个热循环需要黏合的最低温度是由此酵素决定的吗? DNA的长度跟其变性温度有很大的关系 94度大概是双股DNA里面的氢键全部会打开的温度 dsRNA或是DNA-RNA hybrid要再高几度 五十几度是primer黏合到template上面的温度 primer就是人工合成用来放大所需片段用的小片段单股DNA 一般物种的genome大概都是破百万个base pair primer一般是20到30个nucleotide之间 primer会做两个 一左一右刚好把你要的sequence夹起来 那这个五十几度的温度就是primer跟template之间可以开始黏合的温度 template自己的双股因为太大所以没办法这麽快黏起来 接着上72度 这是大部分DNA polymerase最适合工作的温度 效率最高 以基本款的taq polymerase来讲大概一分钟1K的长度 理论上也可以不要上去留在五十几度 不过效率就会很糟 时间就要留很久 然後重复这个cycle 从primer新做好的股又会被打开变成新的template 於是就等比上去了 : 以高温低温的循环让DNA产生2的N次方的放大(N=cycle数) : : 一般都是跑30+cycles 放大几倍可以自己算一下 : : 电泳是把胶体放在溶液里 : : DNA再放在胶体里 : : 溶液通电之後导致大小不同的分子在胶内移动距离不同的现象 : : 定量的部份就是染色後这些分子团显现出的亮度 : : 分子越多越亮 : : 简单说就是这样 : : 然後qPCR : : 就是你提到的萤光 : : 利用的是具有萤光的原料来进行PCR : : 所以在每个cycle的放大中萤光就会逐渐增强 : : 借此来达到定量的效果 : : 那为什麽不全面放弃电泳呢 : : 贵阿 : : qPCR的机器耗材软体有的没的 而且template的纯度要求很高 : : 比起来电泳的成本跟自来水一样(菸) : 在电泳法对分离开来的分子量做量化处理也是使用萤光染剂? : 那跟qpcr这里的萤光染剂有什麽不同阿? : 还有就是real-time pcr 跟qPCR差在哪里阿? : 有网友推文说差再定量方式? : 真的很好奇 : 谢谢您>"< 电泳确实是用萤光染剂没错 不过因为PCR是个奇妙的反应 有可能你的产物到某个浓度就不会再增加了 或是到第几个cycle primer就用完了 因gene而异(也不一定是gene @@) 理论上你可以同时做35管同样的反应 然後在每个cycle终止一管的反应 再全部拿去跑胶 就可以得到类似qPCR的结果 但是很累 所以才有real-time PCR 又称quantitative PCR 或是real-time quantitative PCR的诞生 这个东西严格说起来并不是染剂去与DNA结合 而是它的原料本身会发光 在机器里面反应的过程直接有个detector抓它的吸光酱 这个跟reverse transcription PCR (RT-PCR又是完全的不同) 後者为将RNA反转录成DNA用的 这也牵扯到qPCR的发展 因为学者们对於真正活体内RNA的量很好奇 而前面有提 经过普通的PCR无差别放大之後 你的初始量就几乎不可能定了 因此才会有qPCR的诞生 另外还是要讲一下 google很好用的 维基很多不是最尖端科技的东西资料也都很丰富 自己动手记得会比较牢阿 -- 人好 欠表 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 110.174.79.41 ※ 编辑: Ianthegood 来自: 110.174.79.41 (06/13 00:10)