※ 引述《xenosaga1026 (sam)》之銘言： : 目前實驗設計是要用IP的方式將目標protein抓下來 : 跑SDS-PAGE後挖點 : 再用Mass的方式來看interaction protein : 因為使用的是culture cell (293T) : 怕IP下來的protein量太少Mass會打不到 : 所以目前打算將protein從protein A/G agarose上 : 用 1% SDS elute下來 : 再將4個sample(10cm dish)一起通microcon來濃縮 : 但問題是我怕濃縮後鹽類濃度及SDS濃度會過高 : 不知道microcon能不能去除SDS : 亦或是有其他方法可以去除SDS呢? : 目前實驗面臨最大難題就是protein量不夠 : Mass打出來的結果都在不可信區間(用Mastco搜尋 band都在綠色區間) : 雖然score都有25以上 不知道這些到底能不能用 : 謝謝 如果你是用 in gel digestion 的方式 基本上你用 SDS elution 是不會有問題的 你之前想辦法要去除 SDS 後 後來還是要加 sample buffer, 跑 SDS PAGE, 這些 SDS 還是回來了 有關量的問題 ㄧ般只要是用 Commassia blue 染的到, MS 應該都能分析的到 但如果是silver stain 就很難說了 且不知你最後分析是用 MALDI or LC-MS MALDI ㄧ般設定都會設intensity Top 5 or 20 進入 MS/MS 如果你的真正的 target peak 不是 intensity 最強的, 那也許有雜到其他蛋白質 也許請操作員幫你設定 inclusion list (如果你已經有預設要看到哪個蛋白質了) 如果沒有 也許跑個 LC-MS 幫你把 peptide 分開, 也許會好一點 in gel digestion 的protocol 大部分都是optimize好了 問題不大 但如果是想 IP elute 下來後 直接用in solution digestion 的話 centricon "絕對" 無法幫你把 SDS 去除完全的 只要一點點SDS殘留上質譜 不只你的 data 會毀了 連操作 MS 的人都會很恨你的 這時請用其他方式進行 elution --

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