※ 引述《xenosaga1026 (sam)》之铭言： : 目前实验设计是要用IP的方式将目标protein抓下来 : 跑SDS-PAGE後挖点 : 再用Mass的方式来看interaction protein : 因为使用的是culture cell (293T) : 怕IP下来的protein量太少Mass会打不到 : 所以目前打算将protein从protein A/G agarose上 : 用 1% SDS elute下来 : 再将4个sample(10cm dish)一起通microcon来浓缩 : 但问题是我怕浓缩後盐类浓度及SDS浓度会过高 : 不知道microcon能不能去除SDS : 亦或是有其他方法可以去除SDS呢? : 目前实验面临最大难题就是protein量不够 : Mass打出来的结果都在不可信区间(用Mastco搜寻 band都在绿色区间) : 虽然score都有25以上 不知道这些到底能不能用 : 谢谢 如果你是用 in gel digestion 的方式 基本上你用 SDS elution 是不会有问题的 你之前想办法要去除 SDS 後 後来还是要加 sample buffer, 跑 SDS PAGE, 这些 SDS 还是回来了 有关量的问题 ㄧ般只要是用 Commassia blue 染的到, MS 应该都能分析的到 但如果是silver stain 就很难说了 且不知你最後分析是用 MALDI or LC-MS MALDI ㄧ般设定都会设intensity Top 5 or 20 进入 MS/MS 如果你的真正的 target peak 不是 intensity 最强的, 那也许有杂到其他蛋白质 也许请操作员帮你设定 inclusion list (如果你已经有预设要看到哪个蛋白质了) 如果没有 也许跑个 LC-MS 帮你把 peptide 分开, 也许会好一点 in gel digestion 的protocol 大部分都是optimize好了 问题不大 但如果是想 IP elute 下来後 直接用in solution digestion 的话 centricon "绝对" 无法帮你把 SDS 去除完全的 只要一点点SDS残留上质谱 不只你的 data 会毁了 连操作 MS 的人都会很恨你的 这时请用其他方式进行 elution --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 61.64.240.17