※ 引述《xenosaga1026 (sam)》之銘言： : 目前實驗設計是要用IP的方式將目標protein抓下來 : 跑SDS-PAGE後挖點 : 再用Mass的方式來看interaction protein : 因為使用的是culture cell (293T) : 怕IP下來的protein量太少Mass會打不到 : 所以目前打算將protein從protein A/G agarose上 : 用 1% SDS elute下來 : 再將4個sample(10cm dish)一起通microcon來濃縮 : 但問題是我怕濃縮後鹽類濃度及SDS濃度會過高 : 不知道microcon能不能去除SDS : 亦或是有其他方法可以去除SDS呢? : 目前實驗面臨最大難題就是protein量不夠 : Mass打出來的結果都在不可信區間(用Mastco搜尋 band都在綠色區間) : 雖然score都有25以上 不知道這些到底能不能用 : 謝謝 把濃縮的步驟在跑SDS-PAGE前完成最簡單 可以把蛋白質沉澱再以少量SDS-PAGE的sample buffer回溶 煮完直接load gel 也可以用MICROCON或其他KIT來完成 和MS相比SDS-PAGE可以容忍較多不純物存在而不會干擾結果 跑完SDS-PAGE染色再取點做in gel digestion 這樣出來的樣品如果in gel操作上沒問題是相當純的 上MS絕對沒問題 一般如果染色的band可以用commassie blue染出那對MS分析應該就很足夠了 如果少到要用到silver stain才能看到的話 那有點危險 成功率較低但仍有機會 要找適合MS的silver stain方法否則會造成干擾 另外mascot的分數是要和他網頁的分數比 他結果的網頁上有一行會講分數要超過多少分 p值才會小於0.05 這分數你每個樣品送去分析都不一樣 可能A樣品要40分就OK B樣品要60分才OK 你說在綠色區間那應該p值都沒有小於0.05 不過分析上有很多其他要注意的 照本文所述很難判斷能不能用 如果是要寫在PAPER上可能還要做MS/MS 不能只看MS分數 --

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