※ 引述《xenosaga1026 (sam)》之铭言： : 目前实验设计是要用IP的方式将目标protein抓下来 : 跑SDS-PAGE後挖点 : 再用Mass的方式来看interaction protein : 因为使用的是culture cell (293T) : 怕IP下来的protein量太少Mass会打不到 : 所以目前打算将protein从protein A/G agarose上 : 用 1% SDS elute下来 : 再将4个sample(10cm dish)一起通microcon来浓缩 : 但问题是我怕浓缩後盐类浓度及SDS浓度会过高 : 不知道microcon能不能去除SDS : 亦或是有其他方法可以去除SDS呢? : 目前实验面临最大难题就是protein量不够 : Mass打出来的结果都在不可信区间(用Mastco搜寻 band都在绿色区间) : 虽然score都有25以上 不知道这些到底能不能用 : 谢谢 把浓缩的步骤在跑SDS-PAGE前完成最简单 可以把蛋白质沉淀再以少量SDS-PAGE的sample buffer回溶 煮完直接load gel 也可以用MICROCON或其他KIT来完成 和MS相比SDS-PAGE可以容忍较多不纯物存在而不会干扰结果 跑完SDS-PAGE染色再取点做in gel digestion 这样出来的样品如果in gel操作上没问题是相当纯的 上MS绝对没问题 一般如果染色的band可以用commassie blue染出那对MS分析应该就很足够了 如果少到要用到silver stain才能看到的话 那有点危险 成功率较低但仍有机会 要找适合MS的silver stain方法否则会造成干扰 另外mascot的分数是要和他网页的分数比 他结果的网页上有一行会讲分数要超过多少分 p值才会小於0.05 这分数你每个样品送去分析都不一样 可能A样品要40分就OK B样品要60分才OK 你说在绿色区间那应该p值都没有小於0.05 不过分析上有很多其他要注意的 照本文所述很难判断能不能用 如果是要写在PAPER上可能还要做MS/MS 不能只看MS分数 --

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