作者nurXiah ()
看板Biotech
標題[求救] Western認不到target protein
時間Sat May 28 20:19:32 2011
目前Western呈色出現了問題
兩張膜是同樣的抗原,不同批收下來的,loading濃度相同
一抗1:1000,室溫作用2hr,wash 10min x3
二抗1:10000,室溫作用1hr,wash 10min x4
抗體兩者都是reuse, 前一張呈色能看到target protein,沒有看到雜band
後一張只看到一條明顯的雜band,沒有target protein
呈色時間後者比前者久,SDS-PAGE都有看到target protein
transfer之後染色也確定有轉漬過去
抗體使用只差了一次而已 我的笨腦袋實在想不透到底為什麼會這樣?
請教各位實驗條件能夠做什麼調整 謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 122.118.112.128
1F：→ milkpa:就抗體力價不足啦，差一次就夠他消耗了 05/29 00:38
2F：→ gryou:有些抗體只有一次性 05/29 02:35
3F：→ nurXiah:所以是ㄧ抗的問題?二抗不用動嗎? 05/29 11:17
4F：推 mesenchymal:reuse的確會有差 二抗可以的話也不要reuse 05/29 11:38
5F：→ mesenchymal:一抗要reuse的話也許4度C overnight比較有希望 05/29 11:38
6F：推 reinherd:primary我們只有4c overnight才重複用,2nd Ab不重覆 05/29 11:49
7F：推 jamesonly:不知道能不能重配一抗重壓一次? 05/29 20:49
8F：→ nurXiah:我們家一定都得reuse......之前用新配的5000X一抗,可是背 05/29 21:30
9F：→ nurXiah:景很雜,所以又換回reuse的1000X~如果一抗4度C O/N,二抗還 05/29 21:33
10F：→ nurXiah:要換新的嗎?另外再問一個,為什麼titer掉了反而是非目標基 05/29 21:35
11F：→ nurXiah:因比較明顯?我以為會是剩下的抗體都target到目標蛋白上,雜 05/29 21:38
12F：→ nurXiah:band反而會減少...... 05/29 21:39
13F：推 kakaman:二抗不是不可以重複使用,用個兩次左右就換了吧 06/06 01:10
14F：推 Ferry:東省西省浪費的只是你的時間 06/06 16:52