作者yesdora (話不投機半句多)
看板Biotech
標題[求救] western的band到了下方會變寬
時間Tue May 24 20:33:19 2011
我在跑western時有時會出現像下面這樣的結果
10% gel，stacking 80V 30min, running 150V 50~60min
拍出來的圖片(上半部)
http://ppt.cc/I!-r
拍出來的圖片(下半部，beta-actin)
http://ppt.cc/q5rD
這個同一張膜，我在打一抗之前才把它剪成上下兩片
在上半部的下端可以看出來它擴散了，如果我不剪的話拍出來的照片應該會像梯形那樣
這樣是smiling嗎？
我一直都會同時跑二片膠
但通常出問題的都是其中一片，另一片就很正常(筆直的往下跑)
所以是哪個環節出問題了我也一直很困惑
不曉得是哪裡出問題了，請強者們救救我！
actin被切掉的那個sample我不就等於白做了@@
另外，我看的蛋白質都很大…273和280kda
為了區就actin只好用10%的gel
不曉得有沒有方法可以讓大分子量的蛋白質分離的更開然後又可以用actin補正的方法嗎？？
先感謝大家！m( _ _ )m
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 160.11.143.94
1F：→ blence:根據你的圖,最外面well似乎沒有補sample buffer 05/24 21:28
2F：→ blence:最後一個sample被切掉？ 你切了gel,還是membrane太小張嗎？ 05/24 21:30
我沒有切到膠，membrane的大小幾乎就是膠的大小。
照理說應該都裝得下的，但有時就會出現像梯形的擴散…。
3F：→ blence:如果你用bio-rad系統,可以試試以下的gel condition 05/24 21:31
4F：→ blence:下到上,下膠10%,6cc; 7%,2cc;上膠5%,2cc; 160V,65min很ok 05/24 21:33
我只知道我的marker用的是bio-rad的，機器好像是bio-craft。
不過下次我來試試看！謝謝你提供的方法！
5F：→ k879311:可以嘗試買gradient gel來試試應該是可以分得很開，但要花 05/25 01:20
6F：→ k879311:錢，如果有大片一點的膠也可以分得稍微開一點，至於你說的 05/25 01:28
7F：→ k879311:擴散，你下次可注意看看膠的下半部，當你跑完後拆開來時， 05/25 01:29
8F：→ k879311:會不會有一點波浪狀的起伏，如果有我在跟你講我們實驗室， 05/25 01:31
9F：→ k879311:的之前遇到的狀況；你上半部的膠marker分得如何?marker最 05/25 01:40
10F：→ k879311:大的分子量是kDa? 05/25 01:40
波浪狀偶爾會出現，但我沒有認真去確認是不是波浪狀出現該片膜就會這樣…
marker最大是200，目前看了3個組織都算OK，目標蛋白質很清楚。(上圖的第2條band)
但如果能夠得到你實驗室的經驗就真的是我的榮幸了
方便的話能請你跟我講一下嗎？感激感激！
11F：推 boblu:偷這串：K大 我有時候會看到那種波浪起伏 請問何解 05/25 03:51
12F：推 leoblack:每well把體積調成一致,protein不要load太多,可避免smile 05/25 08:54
well的體積我有盡量讓它不要變形，load量也都沒讓它滿過(本片為例，10μl)
反而有時load 20的時候反而沒變形，所以原因在哪真的好困擾呀…
但還是非常感謝你的意見！
※ 編輯: yesdora 來自: 160.11.143.94 (05/25 11:09)
13F：推 leoblack:我指的是loading體積,每個well都調成一樣,ex 20ul/well 05/25 12:50
14F：→ leoblack:不足的用1X sample dye補,過多的開蓋加熱濃縮體積 05/25 12:51
15F：→ blence:把最外兩個都補上跟其它well同樣體積的sample buffer就好了 05/25 13:36
16F：→ sinighter:有時候大分子量的band會比低分子量的較窄 05/28 22:07
17F：→ sinighter:像我跑mTOR 用的是較大片的膠下面也是會寬很多 05/28 22:07
18F：推 lovenainai:gel 底部的氣泡有沒有去除? 06/13 02:53