作者yesdora (话不投机半句多)
看板Biotech
标题[求救] western的band到了下方会变宽
时间Tue May 24 20:33:19 2011
我在跑western时有时会出现像下面这样的结果
10% gel，stacking 80V 30min, running 150V 50~60min
拍出来的图片(上半部)
http://ppt.cc/I!-r
拍出来的图片(下半部，beta-actin)
http://ppt.cc/q5rD
这个同一张膜，我在打一抗之前才把它剪成上下两片
在上半部的下端可以看出来它扩散了，如果我不剪的话拍出来的照片应该会像梯形那样
这样是smiling吗？
我一直都会同时跑二片胶
但通常出问题的都是其中一片，另一片就很正常(笔直的往下跑)
所以是哪个环节出问题了我也一直很困惑
不晓得是哪里出问题了，请强者们救救我！
actin被切掉的那个sample我不就等於白做了@@
另外，我看的蛋白质都很大…273和280kda
为了区就actin只好用10%的gel
不晓得有没有方法可以让大分子量的蛋白质分离的更开然後又可以用actin补正的方法吗？？
先感谢大家！m( _ _ )m
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 160.11.143.94
1F：→ blence:根据你的图,最外面well似乎没有补sample buffer 05/24 21:28
2F：→ blence:最後一个sample被切掉？ 你切了gel,还是membrane太小张吗？ 05/24 21:30
我没有切到胶，membrane的大小几乎就是胶的大小。
照理说应该都装得下的，但有时就会出现像梯形的扩散…。
3F：→ blence:如果你用bio-rad系统,可以试试以下的gel condition 05/24 21:31
4F：→ blence:下到上,下胶10%,6cc; 7%,2cc;上胶5%,2cc; 160V,65min很ok 05/24 21:33
我只知道我的marker用的是bio-rad的，机器好像是bio-craft。
不过下次我来试试看！谢谢你提供的方法！
5F：→ k879311:可以尝试买gradient gel来试试应该是可以分得很开，但要花 05/25 01:20
6F：→ k879311:钱，如果有大片一点的胶也可以分得稍微开一点，至於你说的 05/25 01:28
7F：→ k879311:扩散，你下次可注意看看胶的下半部，当你跑完後拆开来时， 05/25 01:29
8F：→ k879311:会不会有一点波浪状的起伏，如果有我在跟你讲我们实验室， 05/25 01:31
9F：→ k879311:的之前遇到的状况；你上半部的胶marker分得如何?marker最 05/25 01:40
10F：→ k879311:大的分子量是kDa? 05/25 01:40
波浪状偶尔会出现，但我没有认真去确认是不是波浪状出现该片膜就会这样…
marker最大是200，目前看了3个组织都算OK，目标蛋白质很清楚。(上图的第2条band)
但如果能够得到你实验室的经验就真的是我的荣幸了
方便的话能请你跟我讲一下吗？感激感激！
11F：推 boblu:偷这串：K大 我有时候会看到那种波浪起伏 请问何解 05/25 03:51
12F：推 leoblack:每well把体积调成一致,protein不要load太多,可避免smile 05/25 08:54
well的体积我有尽量让它不要变形，load量也都没让它满过(本片为例，10μl)
反而有时load 20的时候反而没变形，所以原因在哪真的好困扰呀…
但还是非常感谢你的意见！
※ 编辑: yesdora 来自: 160.11.143.94 (05/25 11:09)
13F：推 leoblack:我指的是loading体积,每个well都调成一样,ex 20ul/well 05/25 12:50
14F：→ leoblack:不足的用1X sample dye补,过多的开盖加热浓缩体积 05/25 12:51
15F：→ blence:把最外两个都补上跟其它well同样体积的sample buffer就好了 05/25 13:36
16F：→ sinighter:有时候大分子量的band会比低分子量的较窄 05/28 22:07
17F：→ sinighter:像我跑mTOR 用的是较大片的胶下面也是会宽很多 05/28 22:07
18F：推 lovenainai:gel 底部的气泡有没有去除? 06/13 02:53