※ 引述《TAKAHIRO25 (TAKA)》之銘言： : 最近跑western blot 出現了一些問題 : 壓出來的band 背景都會有拖尾或 band忽大忽小的現象 band 忽大忽小? 考慮定量上是不是有誤差 , 一開始跑不建議超過100V 過了上層膠再開到100V : 我列出我實驗的步驟 : 想請學長姐們可否幫我看看有哪些需要改進的地方 : 我收細胞目前是用trypsin收的 還沒用過lysis buffer 收過 建議用刮的 (加lysis buffer破細胞) 效果還不錯 : 收下來的pellet 則是看pellet大小 加入等量的 2X sample buffer 和PBS : 接著再煮10min 兩次至三次 將pellet煮散 : (但目前問題是有時pellet過大都會很難全部煮散掉，不知道是不是 因為這樣才導致band有拖尾的現象? 其中也試著vortex很多次試著讓pellet完全溶解， 而且有時要煮很多次，不知道對protein有沒有影響? 不知有沒有較容易煮散pellet的方法) 收下來 pellet 太多可多加一點 buffer 進去沒錯 , 但為什麼不一開始就把細胞數目 控制好? 還是找到一個適合的數目再去做會比較好 (比如說 10cm dish 八分滿) 煮 protein 正常來說 , 95度 C , 5~10 分鐘就夠了! 不用再煮第二次 製膠方面 下膠凝固後需要等30min~到1小時再製上膠嗎? : 因為在網路上查 很多實驗室好像都是這樣做的 : 我是製完下膠只要凝固後就馬上製上膠了 : 等膠製完會放到4度c冰箱放隔夜 再跑膠 : 隔天膠從冰箱拿出來後需要等冷卻嗎? 下膠至少等20分鐘以上 , 冰過後不需要冷卻也可以跑 : 我目前是拿出來等5min就 加入sample了 : 跑膠和transfer這裡就先省略 : transfer完後 : Membrane需要 wash嗎? 我這裡是以1/4 TBST稍微洗一下 不需要 wash ,可用 Ponceau 染染看轉過去 band 的轉弱 : 接著再blocking 兩小時 (blocking buffer 是用1X TBS + 脫脂奶粉) TBS 記得加 tween20 : blocking結束後 以1X TBST wash 5min : 再加入1抗 4度C overnight : 隔天吸掉1抗 以1X TBST wash 5min 3次 : 再加入2抗 室溫 1小時 : 以上是我的實驗步驟 : 還請各位學長姐們幫我看看有哪裡需要改進的地方 : 謝謝 --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.42.72.124