※ 引述《TAKAHIRO25 (TAKA)》之铭言： : 最近跑western blot 出现了一些问题 : 压出来的band 背景都会有拖尾或 band忽大忽小的现象 band 忽大忽小? 考虑定量上是不是有误差 , 一开始跑不建议超过100V 过了上层胶再开到100V : 我列出我实验的步骤 : 想请学长姐们可否帮我看看有哪些需要改进的地方 : 我收细胞目前是用trypsin收的 还没用过lysis buffer 收过 建议用刮的 (加lysis buffer破细胞) 效果还不错 : 收下来的pellet 则是看pellet大小 加入等量的 2X sample buffer 和PBS : 接着再煮10min 两次至三次 将pellet煮散 : (但目前问题是有时pellet过大都会很难全部煮散掉，不知道是不是 因为这样才导致band有拖尾的现象? 其中也试着vortex很多次试着让pellet完全溶解， 而且有时要煮很多次，不知道对protein有没有影响? 不知有没有较容易煮散pellet的方法) 收下来 pellet 太多可多加一点 buffer 进去没错 , 但为什麽不一开始就把细胞数目 控制好? 还是找到一个适合的数目再去做会比较好 (比如说 10cm dish 八分满) 煮 protein 正常来说 , 95度 C , 5~10 分钟就够了! 不用再煮第二次 制胶方面 下胶凝固後需要等30min~到1小时再制上胶吗? : 因为在网路上查 很多实验室好像都是这样做的 : 我是制完下胶只要凝固後就马上制上胶了 : 等胶制完会放到4度c冰箱放隔夜 再跑胶 : 隔天胶从冰箱拿出来後需要等冷却吗? 下胶至少等20分钟以上 , 冰过後不需要冷却也可以跑 : 我目前是拿出来等5min就 加入sample了 : 跑胶和transfer这里就先省略 : transfer完後 : Membrane需要 wash吗? 我这里是以1/4 TBST稍微洗一下 不需要 wash ,可用 Ponceau 染染看转过去 band 的转弱 : 接着再blocking 两小时 (blocking buffer 是用1X TBS + 脱脂奶粉) TBS 记得加 tween20 : blocking结束後 以1X TBST wash 5min : 再加入1抗 4度C overnight : 隔天吸掉1抗 以1X TBST wash 5min 3次 : 再加入2抗 室温 1小时 : 以上是我的实验步骤 : 还请各位学长姐们帮我看看有哪里需要改进的地方 : 谢谢 --

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