作者TAKAHIRO25 (TAKA)
看板Biotech
標題[求救] western 問題
時間Sat May 21 14:32:28 2011
最近跑western blot 出現了一些問題
壓出來的band 背景都會有拖尾或 band忽大忽小的現象
我列出我實驗的步驟
想請學長姐們可否幫我看看有哪些需要改進的地方
我收細胞目前是用trypsin收的 還沒用過lysis buffer 收過
收下來的pellet 則是看pellet大小 加入等量的 2X sample buffer 和PBS
接著再煮10min 兩次至三次 將pellet煮散
(但目前問題是有時pellet過大都會很難全部煮散掉，不知道是不是因為這樣才導致band有拖尾的現象? 其中也試著vortex很多次試著讓pellet完全溶解，而且有時要煮很多次，不知道對protein有沒有影響? 不知有沒有較容易煮散pellet的方法)
製膠方面 下膠凝固後需要等30min~到1小時再製上膠嗎?
因為在網路上查 很多實驗室好像都是這樣做的
我是製完下膠只要凝固後就馬上製上膠了
等膠製完會放到4度c冰箱放隔夜 再跑膠
隔天膠從冰箱拿出來後需要等冷卻嗎?
我目前是拿出來等5min就 加入sample了
跑膠和transfer這裡就先省略
transfer完後
Membrane需要 wash嗎? 我這裡是以1/4 TBST稍微洗一下
接著再blocking 兩小時 (blocking buffer 是用1X TBS + 脫脂奶粉)
blocking結束後 以1X TBST wash 5min
再加入1抗 4度C overnight
隔天吸掉1抗 以1X TBST wash 5min 3次
再加入2抗 室溫 1小時
以上是我的實驗步驟
還請各位學長姐們幫我看看有哪裡需要改進的地方
謝謝
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◆ From: 163.15.177.188
1F：推 aggaci:建議你 用RIPA把細胞打破收上清液再跑，一定能改善 05/21 17:47
2F：推 mgh225:那可以把煮過的 total cell lysate 直接離心取上清去跑膠嗎 05/21 21:56
3F：推 juyi7:我會建議你再離心～你會發現還是有些PELLET 06/19 19:47