最近跑western blot 出现了一些问题 压出来的band 背景都会有拖尾或 band忽大忽小的现象 我列出我实验的步骤 想请学长姐们可否帮我看看有哪些需要改进的地方 我收细胞目前是用trypsin收的 还没用过lysis buffer 收过 收下来的pellet 则是看pellet大小 加入等量的 2X sample buffer 和PBS 接着再煮10min 两次至三次 将pellet煮散 (但目前问题是有时pellet过大都会很难全部煮散掉，不知道是不是因为这样才导致band有拖尾的现象? 其中也试着vortex很多次试着让pellet完全溶解，而且有时要煮很多次，不知道对protein有没有影响? 不知有没有较容易煮散pellet的方法) 制胶方面 下胶凝固後需要等30min~到1小时再制上胶吗? 因为在网路上查 很多实验室好像都是这样做的 我是制完下胶只要凝固後就马上制上胶了 等胶制完会放到4度c冰箱放隔夜 再跑胶 隔天胶从冰箱拿出来後需要等冷却吗? 我目前是拿出来等5min就 加入sample了 跑胶和transfer这里就先省略 transfer完後 Membrane需要 wash吗? 我这里是以1/4 TBST稍微洗一下 接着再blocking 两小时 (blocking buffer 是用1X TBS + 脱脂奶粉) blocking结束後 以1X TBST wash 5min 再加入1抗 4度C overnight 隔天吸掉1抗 以1X TBST wash 5min 3次 再加入2抗 室温 1小时 以上是我的实验步骤 还请各位学长姐们帮我看看有哪里需要改进的地方 谢谢 --

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