作者mgh225 (..)
看板Biotech
標題[方法] blunt-end ligation 的 protocol
時間Fri May 20 21:16:35 2011
最近在做 blunt-end ligation
不過不知道到底哪裡出了問題
總是接不起來
不然就是長了 colony 後，去RE digest check 都是怪怪的 size
所以想來這邊詢問有沒有人有做過 blunt-end ligation的經驗
可以和我說一下須要注意的地方
和實驗的步驟流程呢
謝謝
1. DNA vector 11.9 kb
insert 2.2 kb
2. DNA vector 11.9kb
insert 2 kb
因為我是 subcloning 的關係所以我先將 insert 和 vector 分別用兩組 re double
digest，接著 gel extraction ~> ciap treat (37度，30 MIN) ~> add Klenow
fragment (TAKARA) ~> 10:1 ligation (16 度C， overnight) ~> transformation
大概流程是這樣，還需要什麼資訊我再補充~謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.79.51
1F：推 dodomilk:我覺得你最好把你DNA長怎樣、用哪些藥品、怎麼做都列出來 05/20 21:34
※ 編輯: mgh225 來自: 140.112.79.51 (05/20 21:41)
2F：→ dodomilk:版友才有辦法幫你偵錯...ligation可能發生的問題太多了 05/20 21:35
3F：推 dodomilk:最簡單的建議：每一個步驟都做一個positive control 05/20 21:37
4F：→ dodomilk:確認你那個步驟的條件、藥品有沒有問題 05/20 21:38
5F：→ mgh225:我想我可能需要一個正確的protocol 05/20 21:42
6F：推 micocat:跟一般的ligation一樣啊 05/21 00:38
7F：→ gryou:有試過其他比例嗎？1:4 or 1:6 05/21 13:10
8F：推 icome:blunt end不好接 最好別用CIP 除非你只用一刀 05/21 23:04
9F：→ Realthugz:一刀兩刀都是blunt end阿... 05/22 00:06
10F：推 icome:喔 我以為是一端blunt 一端sticky 兩端都blunt我沒做過... 05/22 10:14