作者mgh225 (..)
看板Biotech
标题[方法] blunt-end ligation 的 protocol
时间Fri May 20 21:16:35 2011
最近在做 blunt-end ligation
不过不知道到底哪里出了问题
总是接不起来
不然就是长了 colony 後，去RE digest check 都是怪怪的 size
所以想来这边询问有没有人有做过 blunt-end ligation的经验
可以和我说一下须要注意的地方
和实验的步骤流程呢
谢谢
1. DNA vector 11.9 kb
insert 2.2 kb
2. DNA vector 11.9kb
insert 2 kb
因为我是 subcloning 的关系所以我先将 insert 和 vector 分别用两组 re double
digest，接着 gel extraction ~> ciap treat (37度，30 MIN) ~> add Klenow
fragment (TAKARA) ~> 10:1 ligation (16 度C， overnight) ~> transformation
大概流程是这样，还需要什麽资讯我再补充~谢谢
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.79.51
1F：推 dodomilk:我觉得你最好把你DNA长怎样、用哪些药品、怎麽做都列出来 05/20 21:34
※ 编辑: mgh225 来自: 140.112.79.51 (05/20 21:41)
2F：→ dodomilk:版友才有办法帮你侦错...ligation可能发生的问题太多了 05/20 21:35
3F：推 dodomilk:最简单的建议：每一个步骤都做一个positive control 05/20 21:37
4F：→ dodomilk:确认你那个步骤的条件、药品有没有问题 05/20 21:38
5F：→ mgh225:我想我可能需要一个正确的protocol 05/20 21:42
6F：推 micocat:跟一般的ligation一样啊 05/21 00:38
7F：→ gryou:有试过其他比例吗？1:4 or 1:6 05/21 13:10
8F：推 icome:blunt end不好接 最好别用CIP 除非你只用一刀 05/21 23:04
9F：→ Realthugz:一刀两刀都是blunt end阿... 05/22 00:06
10F：推 icome:喔 我以为是一端blunt 一端sticky 两端都blunt我没做过... 05/22 10:14