作者dummytrue (就只是大叔而已)
看板Biotech
標題[求救] 有關純化蛋白的問題
時間Thu May 19 14:08:26 2011
我用的是pichia表現系統
按照invitrogen的protocol
plasmid是pPPIczα
在小量表現的時候收連續三天induction的medium做western blot
用anti-his抗體去認 可以認到有dose變化的single band
可是問題在大量表現後
收medium 過Ni-colum後 上AKTA 用0.5M imidazole 沖出
大概在40-50%的時候會有peak出現
收fraction後跑western blot
一樣用anti-his抗體去認
結果就斷得亂七八糟了(每個位置都有band 還是smear的)
有可能是imidazole的關係嗎
因為我有把大量表現indution三天後的medium收一些下來跑western blot
結果還是正常的single band 所以再想應該是純化的過程有問題
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.98.126
1F：推 abcam:我覺的會不是 Ni-colum 沒有純化好? 05/19 23:35
2F：→ dummytrue:樓上是指ni和蛋白發生某種作用了嗎? 05/20 10:33
3F：推 tanpus:會不會是過colum的時間長 蛋白被某種proteinase水解啊? 05/20 15:41
4F：推 inchew:1.純化產物有雜蛋白且抗體亂黏 2.也可能是protease水解→ 05/27 14:54
5F：→ inchew:請改用protease deficient strains ex. pichia SMD1168 05/27 14:55
6F：推 wahl:Yeast表現系統 一般不建議使用His-tag...background太高 05/30 00:17
7F：推 arohaii:收完medium你有馬上純化嘛？還是只是4度c冷藏 06/13 21:36