作者dummytrue (就只是大叔而已)
看板Biotech
标题[求救] 有关纯化蛋白的问题
时间Thu May 19 14:08:26 2011
我用的是pichia表现系统
按照invitrogen的protocol
plasmid是pPPIczα
在小量表现的时候收连续三天induction的medium做western blot
用anti-his抗体去认 可以认到有dose变化的single band
可是问题在大量表现後
收medium 过Ni-colum後 上AKTA 用0.5M imidazole 冲出
大概在40-50%的时候会有peak出现
收fraction後跑western blot
一样用anti-his抗体去认
结果就断得乱七八糟了(每个位置都有band 还是smear的)
有可能是imidazole的关系吗
因为我有把大量表现indution三天後的medium收一些下来跑western blot
结果还是正常的single band 所以再想应该是纯化的过程有问题
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.98.126
1F：推 abcam:我觉的会不是 Ni-colum 没有纯化好? 05/19 23:35
2F：→ dummytrue:楼上是指ni和蛋白发生某种作用了吗? 05/20 10:33
3F：推 tanpus:会不会是过colum的时间长 蛋白被某种proteinase水解啊? 05/20 15:41
4F：推 inchew:1.纯化产物有杂蛋白且抗体乱黏 2.也可能是protease水解→ 05/27 14:54
5F：→ inchew:请改用protease deficient strains ex. pichia SMD1168 05/27 14:55
6F：推 wahl:Yeast表现系统 一般不建议使用His-tag...background太高 05/30 00:17
7F：推 arohaii:收完medium你有马上纯化嘛？还是只是4度c冷藏 06/13 21:36