作者steerboss (沒口德的人還真是多)
看板Biotech
標題[求救] real time PCR 結果不穩定
時間Wed May 18 12:13:11 2011
各位大大好
最近做real time PCR的時候遇到了一些問題
使用的機型是Roche Light Cycler 480
probe 是使用Taqman hydrolysis probe
每個sample都做三重複
RNA的部分是由T7 RNA polymerase轉錄出的cRNA
一共有7種不同序列的cRNA
RNA 的 OD 260/280都有1.8以上
每個cRNA smaple都做10倍系列稀釋
上周做1~4號的cRNA結果都很正常，稀釋1000倍的sample Ct值大約都在13左右
但是這週做5~7號的cRNA
稀釋1000倍的sample Ct值卻跑到30上下
想請問各位大大
在實驗條件跟reagent的都相同的情況下
還有甚麼原因會造成這種狀況呢?
謝謝~
p.s.補充一下，我是用cRNA系列稀釋之後做one-step real time PCR，
然後7個cRNA sample的濃度都在1.8ug/ul左右。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.95.218
1F：推 aeroufo:妳在反轉錄前有定量嗎?? 05/18 12:25
2F：→ steerboss:反轉錄前倒是沒有進行過定量，我是抽完plasmid後拿一點 05/18 12:45
3F：→ steerboss:去跑電泳，亮度夠就直接拿去做反轉錄了，因為7個clone 05/18 12:45
4F：→ steerboss:都是同時抽然後同時跑電泳，然後同時進行反轉錄，所以我 05/18 12:46
5F：→ steerboss:不太懂條件都相同的狀況下為什麼有三組就做不出來 @@ 05/18 12:46
6F：→ a90648:拿去轉cDNA的濃度沒定量就不相同啦 05/18 14:48
7F：→ steerboss:@@可是我7個cNDA clone轉出來的cRNA濃度都在1.8ug/ul 05/18 15:07
8F：→ steerboss:左右，因為7個cRNA sample的濃度都差不多，可是卻有3個 05/18 15:09
9F：→ steerboss:跑出來的Ct值差異很大，所以我不清楚問題是出在哪 Q_Q 05/18 15:10
※ 編輯: steerboss 來自: 163.25.95.218 (05/18 15:14)
10F：→ gerpy:cRNA保存在那個地方？ 會不會是cRNA degradation， 05/18 19:33
11F：→ gerpy:樣本有剩，就再做一次同時間1-7號樣本的One step QPCR 05/18 19:34
12F：→ steerboss:cRNA保存在-80冰箱 05/19 10:31