作者steerboss (没口德的人还真是多)
看板Biotech
标题[求救] real time PCR 结果不稳定
时间Wed May 18 12:13:11 2011
各位大大好
最近做real time PCR的时候遇到了一些问题
使用的机型是Roche Light Cycler 480
probe 是使用Taqman hydrolysis probe
每个sample都做三重复
RNA的部分是由T7 RNA polymerase转录出的cRNA
一共有7种不同序列的cRNA
RNA 的 OD 260/280都有1.8以上
每个cRNA smaple都做10倍系列稀释
上周做1~4号的cRNA结果都很正常，稀释1000倍的sample Ct值大约都在13左右
但是这周做5~7号的cRNA
稀释1000倍的sample Ct值却跑到30上下
想请问各位大大
在实验条件跟reagent的都相同的情况下
还有甚麽原因会造成这种状况呢?
谢谢~
p.s.补充一下，我是用cRNA系列稀释之後做one-step real time PCR，
然後7个cRNA sample的浓度都在1.8ug/ul左右。
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.95.218
1F：推 aeroufo:你在反转录前有定量吗?? 05/18 12:25
2F：→ steerboss:反转录前倒是没有进行过定量，我是抽完plasmid後拿一点 05/18 12:45
3F：→ steerboss:去跑电泳，亮度够就直接拿去做反转录了，因为7个clone 05/18 12:45
4F：→ steerboss:都是同时抽然後同时跑电泳，然後同时进行反转录，所以我 05/18 12:46
5F：→ steerboss:不太懂条件都相同的状况下为什麽有三组就做不出来 @@ 05/18 12:46
6F：→ a90648:拿去转cDNA的浓度没定量就不相同啦 05/18 14:48
7F：→ steerboss:@@可是我7个cNDA clone转出来的cRNA浓度都在1.8ug/ul 05/18 15:07
8F：→ steerboss:左右，因为7个cRNA sample的浓度都差不多，可是却有3个 05/18 15:09
9F：→ steerboss:跑出来的Ct值差异很大，所以我不清楚问题是出在哪 Q_Q 05/18 15:10
※ 编辑: steerboss 来自: 163.25.95.218 (05/18 15:14)
10F：→ gerpy:cRNA保存在那个地方？ 会不会是cRNA degradation， 05/18 19:33
11F：→ gerpy:样本有剩，就再做一次同时间1-7号样本的One step QPCR 05/18 19:34
12F：→ steerboss:cRNA保存在-80冰箱 05/19 10:31