作者TCSSH ()
看板Biotech
標題[求救] western的running和壓片
時間Sat May 14 16:37:36 2011
http://img705.imageshack.us/g/dsc00711ta.jpg/
1.loading的問題 近一個月做的實驗在running時都會有殘餘東西在每個well上
黑黑灰灰的 本來以為是sample煮完後太熱*(sample煮30min) 所以我接下來煮完後
會將sample 放在冰上十分鐘 結果還是一樣 也有曾經懷疑是dye的問題
但是過濾後情況依舊 在想會不會是loading太多sample*(我loading 200ug)
這個還沒試不知道 但是一直試時間一過就是一個月 心理有點急了
實在不知道這樣的問題在哪邊 不知道有沒有先進遇過同樣的問題
(再試下去我看我就來不及口試了...)
2.壓片的問題 就如同圖中那張海苔一樣 我搞不懂為啥會這樣 囧
本來以為是一抗的問題重泡結果居然一樣 二抗也重泡過 結果都一樣 囧
搞不懂是因為我已經有N了 且實驗過程都一樣 除了最近在running出現的疑似遺留物
怕提供的資料太少 我稍微說一下我的流程好了
處理完sample, 定量(200ug), 煮30min,放冰上十分鐘, loading, run 30min 90v
then 1hr 120v 讓55跑到底(我看pAMPK 63kda),transfer 70 min 90V
(35min換一次冰),blocking(5% milk) 30min, wash 3x10 min in TTBS,
一抗 pAMPK 1:1000 in 5% milk 溶劑是用TTBS over night 4度C, wash 3x10 min,
二抗 室溫 2hr, wash 3x10 min, 壓片... 感謝讀完的人 現在頭在燒的人留
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 203.64.80.190
1F：推 FENOR:第一次看到海苔狀... 05/14 17:01
2F：→ FENOR:你要不要先去檢查壓片夾裡面有沒有怪怪的東西卡住 05/14 17:02
3F：推 liuse:200ug..... 05/14 17:04
4F：推 Marriott:200ug應該不是問題,我loading過20mg/well也沒事 05/14 17:28
5F：→ TCSSH:應該不會有 因為我們是自己用顯影 定影濟洗的(人工) 05/14 18:14
6F：→ TCSSH:昨天還被老闆念 一直不量解之前有做出來 現在卻一個月沒DATA 05/14 18:18
7F：→ FENOR:這個實驗是你第一次做嗎? 我指的是你第一次用這支抗體嗎? 05/14 18:56
8F：→ FENOR:另外我說的壓片夾，指的是你再放底片進去和membrane成色時 05/14 18:58
9F：→ FENOR:用的那一個。 05/14 18:58
10F：→ TCSSH:不是耶 這隻抗體是之前使用的 XD 05/14 19:13
11F：→ TCSSH:至於壓片夾 我確定沒異物 XD 05/14 19:13
12F：→ FENOR:那我真的不知道怎麼辦了@@ 05/14 19:49
13F：→ spirithorse:以前有做出來,是你做的嗎??要仔細想一下跟現在哪個 05/14 23:39
14F：→ spirithorse:步驟變了! 05/14 23:39
15F：→ jsi:或許可重新配置dye以及buffer 海苔是指一整片黑嗎?可能是抗體 05/15 00:39
16F：→ jsi:太濃 05/15 00:41
17F：→ FENOR:你看看要不要不要loading那麼多，先來個20ug試試看 05/15 00:41
18F：→ kcc0606:loading 200ug,1抗又overnight 訊號一定爆強,可考慮ECL稀 05/15 01:11
19F：→ kcc0606:釋個10~20倍去壓片.做IP時我才會用到200ug/lane 05/15 01:13
20F：→ kcc0606:你的SAMPLE會有沉澱物嗎?如果是 就是sample buffer里的 05/15 01:17
21F：→ kcc0606:SDS成份含量高,DENATURE後可考慮不要放冰上.另外好奇 05/15 01:19
22F：→ kcc0606:denature為何要30min?煮那麼長 sample buffer顏色不會變嗎 05/15 01:20
23F：→ TCSSH:謝謝各位先進的建議 我會在試試！！ 05/15 23:15
24F：→ sinighter:2抗dilute比例多少阿 一般我會先嘗試比1抗稀兩倍比例 05/16 01:37
25F：→ sinighter:感覺是2抗太強或是ECL用太強的 05/16 01:40