作者TCSSH ()
看板Biotech
标题[求救] western的running和压片
时间Sat May 14 16:37:36 2011
http://img705.imageshack.us/g/dsc00711ta.jpg/
1.loading的问题 近一个月做的实验在running时都会有残余东西在每个well上
黑黑灰灰的 本来以为是sample煮完後太热*(sample煮30min) 所以我接下来煮完後
会将sample 放在冰上十分钟 结果还是一样 也有曾经怀疑是dye的问题
但是过滤後情况依旧 在想会不会是loading太多sample*(我loading 200ug)
这个还没试不知道 但是一直试时间一过就是一个月 心理有点急了
实在不知道这样的问题在哪边 不知道有没有先进遇过同样的问题
(再试下去我看我就来不及口试了...)
2.压片的问题 就如同图中那张海苔一样 我搞不懂为啥会这样 囧
本来以为是一抗的问题重泡结果居然一样 二抗也重泡过 结果都一样 囧
搞不懂是因为我已经有N了 且实验过程都一样 除了最近在running出现的疑似遗留物
怕提供的资料太少 我稍微说一下我的流程好了
处理完sample, 定量(200ug), 煮30min,放冰上十分钟, loading, run 30min 90v
then 1hr 120v 让55跑到底(我看pAMPK 63kda),transfer 70 min 90V
(35min换一次冰),blocking(5% milk) 30min, wash 3x10 min in TTBS,
一抗 pAMPK 1:1000 in 5% milk 溶剂是用TTBS over night 4度C, wash 3x10 min,
二抗 室温 2hr, wash 3x10 min, 压片... 感谢读完的人 现在头在烧的人留
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 203.64.80.190
1F：推 FENOR:第一次看到海苔状... 05/14 17:01
2F：→ FENOR:你要不要先去检查压片夹里面有没有怪怪的东西卡住 05/14 17:02
3F：推 liuse:200ug..... 05/14 17:04
4F：推 Marriott:200ug应该不是问题,我loading过20mg/well也没事 05/14 17:28
5F：→ TCSSH:应该不会有 因为我们是自己用显影 定影济洗的(人工) 05/14 18:14
6F：→ TCSSH:昨天还被老板念 一直不量解之前有做出来 现在却一个月没DATA 05/14 18:18
7F：→ FENOR:这个实验是你第一次做吗? 我指的是你第一次用这支抗体吗? 05/14 18:56
8F：→ FENOR:另外我说的压片夹，指的是你再放底片进去和membrane成色时 05/14 18:58
9F：→ FENOR:用的那一个。 05/14 18:58
10F：→ TCSSH:不是耶 这只抗体是之前使用的 XD 05/14 19:13
11F：→ TCSSH:至於压片夹 我确定没异物 XD 05/14 19:13
12F：→ FENOR:那我真的不知道怎麽办了@@ 05/14 19:49
13F：→ spirithorse:以前有做出来,是你做的吗??要仔细想一下跟现在哪个 05/14 23:39
14F：→ spirithorse:步骤变了! 05/14 23:39
15F：→ jsi:或许可重新配置dye以及buffer 海苔是指一整片黑吗?可能是抗体 05/15 00:39
16F：→ jsi:太浓 05/15 00:41
17F：→ FENOR:你看看要不要不要loading那麽多，先来个20ug试试看 05/15 00:41
18F：→ kcc0606:loading 200ug,1抗又overnight 讯号一定爆强,可考虑ECL稀 05/15 01:11
19F：→ kcc0606:释个10~20倍去压片.做IP时我才会用到200ug/lane 05/15 01:13
20F：→ kcc0606:你的SAMPLE会有沉淀物吗?如果是 就是sample buffer里的 05/15 01:17
21F：→ kcc0606:SDS成份含量高,DENATURE後可考虑不要放冰上.另外好奇 05/15 01:19
22F：→ kcc0606:denature为何要30min?煮那麽长 sample buffer颜色不会变吗 05/15 01:20
23F：→ TCSSH:谢谢各位先进的建议 我会在试试！！ 05/15 23:15
24F：→ sinighter:2抗dilute比例多少阿 一般我会先尝试比1抗稀两倍比例 05/16 01:37
25F：→ sinighter:感觉是2抗太强或是ECL用太强的 05/16 01:40