※ 引述《twcitizen (Sterco-Cephaly)》之銘言： : ※ 引述《mikis1107 (mikis1107)》之銘言： : : 我想請問冷凍切片的免疫螢光染色結果 : : sample組上面出現的小黃點是甚麼東西 : : 有方法可以避免嗎? : 我有做過組織免疫染色以及相關hybrdization實驗 : 不過之事很久沒有更新，請指教 : 第一點 : back-round noise (white noise) : 對於white noise，增加signal是個不錯的方法 : 但是減少noise也很重要 : S/N比會上升 : : 去OCT : : lysotracker 50 nM, 37度, 40 min : 既然是免疫染色，使用lysotracker(?是一種probe?)要做什麼？ 喔喔這是lysosme的maker : : PBS wash : : 4% paraformaldehyde固定 RT 10 min : 既然是冷凍切片，為何還要用固定過程？ : 多一項過程就會多很多項變數 因為我看on line protocol也都是有fix的步驟 可能是因為要固定內部蛋白表現 : : wash : : 1% BSA RT 50 min : : wash : BSA或許不錯，有試過其他的blocking agent? 目前正在試二級抗體的serum 一般用5% 要試的條件5%跟10% goat-serum 根據abcm onlne protocol 有說用paraformaldelyte固定的section 可能會產生許多free aldehyde group 造成高度的background 可以在blocking buffer中加入0.3M 的 glycine與之結合 降低背景值 或是換成aceton來block 這我試過但是染出來的效果會有螢光不均勻的現象 目前兩者也在試驗階段 : : 一級抗體 in 1% BSA 4度 O/N : : wash : : 二級抗體(488) in 1% BSA 37度 15 min : : wash : : Hochest 1:4000 RT 15 min : : wash, mounting : : 有詢問過學姊 : : 因為rat heat是自己取的有洗的比較乾淨 : : 而sample是請別人取的 : : 說可能是紅血球沒有清洗乾淨的關係@@ : 這要看你的一級與二級AB針對的是什麼 : AB絕對不可能100％只針對target tissue抓上去 : 你去問學姐不如問教授，或者拿AB的data sheet來研究 : 上網去查這些AB有哪些人用過？他們的M＆M？ : 他們的結果與可能的noise在哪裡？ : 去問別人之前，自己做點功課會比較好 : : 學姊有建議我可以用biotin放大目標蛋白的訊號 : : 就是一級抗體+二級抗體接biotin+三級抗體接biotin : : (應該是這樣吧@@) : 假設 S = 5, N = 3 : 你使用增強的S = 7，但是別忘了noise是出自哪裡？ : 如果跟你的M＆M直接相關（例如1st, 2nd Ab) : 那麼你的N也會增強，就比如N = 4 : 前S/N = 5/3 = 1.67 : 後S/N = 7/4 = 1.75 : 是有比較好，但是沒有好多少，noise的問題你不知道，就還是在那裡 : 只是就以前的經驗分享，當然請各位高手指正 感謝您的分享 就我目前手邊在try的條件會先試過在上來問人 感恩^_____^ --

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