※ 引述《twcitizen (Sterco-Cephaly)》之铭言： : ※ 引述《mikis1107 (mikis1107)》之铭言： : : 我想请问冷冻切片的免疫萤光染色结果 : : sample组上面出现的小黄点是甚麽东西 : : 有方法可以避免吗? : 我有做过组织免疫染色以及相关hybrdization实验 : 不过之事很久没有更新，请指教 : 第一点 : back-round noise (white noise) : 对於white noise，增加signal是个不错的方法 : 但是减少noise也很重要 : S/N比会上升 : : 去OCT : : lysotracker 50 nM, 37度, 40 min : 既然是免疫染色，使用lysotracker(?是一种probe?)要做什麽？ 喔喔这是lysosme的maker : : PBS wash : : 4% paraformaldehyde固定 RT 10 min : 既然是冷冻切片，为何还要用固定过程？ : 多一项过程就会多很多项变数 因为我看on line protocol也都是有fix的步骤 可能是因为要固定内部蛋白表现 : : wash : : 1% BSA RT 50 min : : wash : BSA或许不错，有试过其他的blocking agent? 目前正在试二级抗体的serum 一般用5% 要试的条件5%跟10% goat-serum 根据abcm onlne protocol 有说用paraformaldelyte固定的section 可能会产生许多free aldehyde group 造成高度的background 可以在blocking buffer中加入0.3M 的 glycine与之结合 降低背景值 或是换成aceton来block 这我试过但是染出来的效果会有萤光不均匀的现象 目前两者也在试验阶段 : : 一级抗体 in 1% BSA 4度 O/N : : wash : : 二级抗体(488) in 1% BSA 37度 15 min : : wash : : Hochest 1:4000 RT 15 min : : wash, mounting : : 有询问过学姊 : : 因为rat heat是自己取的有洗的比较乾净 : : 而sample是请别人取的 : : 说可能是红血球没有清洗乾净的关系@@ : 这要看你的一级与二级AB针对的是什麽 : AB绝对不可能100％只针对target tissue抓上去 : 你去问学姐不如问教授，或者拿AB的data sheet来研究 : 上网去查这些AB有哪些人用过？他们的M＆M？ : 他们的结果与可能的noise在哪里？ : 去问别人之前，自己做点功课会比较好 : : 学姊有建议我可以用biotin放大目标蛋白的讯号 : : 就是一级抗体+二级抗体接biotin+三级抗体接biotin : : (应该是这样吧@@) : 假设 S = 5, N = 3 : 你使用增强的S = 7，但是别忘了noise是出自哪里？ : 如果跟你的M＆M直接相关（例如1st, 2nd Ab) : 那麽你的N也会增强，就比如N = 4 : 前S/N = 5/3 = 1.67 : 後S/N = 7/4 = 1.75 : 是有比较好，但是没有好多少，noise的问题你不知道，就还是在那里 : 只是就以前的经验分享，当然请各位高手指正 感谢您的分享 就我目前手边在try的条件会先试过在上来问人 感恩^_____^ --

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