感謝各位的幫助 我做了以下的修改終於有長了~ (雖然還不知道送進去的是不是對的,但至少有送進去^^") ※ 引述《flyhuman (睡魔海 )》之銘言： : 我的insert大小是1050bp vector大小是9193bp : insert已經接到TA vector上 定序也確定序列都對 : 現在是設計帶有EcoRI跟XbaI restriction site的primer : forward:gctctagagc-atg....... : reverse:cggaattccg-tta....... : 然後經過PCR放大insert之後 做一次DNA elution : 再來將insert跟vector作RE,37度C,40min : (之所以會切這麼短時間,因為老闆說放太久EcoRI會亂切...) RE的時間我調整成1hr : 然後65度C inactivation,15min : 之後拿去run gel : 作gel elution : 測完濃度之後準備作ligation : insert跟vector濃度大都在50ng/ul : 我的vector input 75ng : 我已經試過molar ratio vector:insert=1:3,1:5,1:10 :1:5有長~1:10也有長(但是我是改用體積比...) : 然後T4 DNA ligase 1ul,2 X buffer 5ul : 總體積10ul, ligation overnight 跟別人借了TAKARA的T4 DNA ligase ligase 0.5ul, 10X buffer 1ul, insert跟vector相對可以加比較多 總體積依舊是10ul, ligation 4度C overnight : 隔天做transformation : competent cell是用益生的DH10B 也用過JM109 這次作了兩組對照組 DH10B只長1顆 JM109長了10顆 有人用過DH10B嗎??? 之前用DH10B作TA就做得出來 但是現在用ligation product就做不出來了 是不是competent cell的問題??? (當初好像買錯= = 本來是要買DH5alpha的) : 之前有做過轉空vector進去有成功 : transform的過程: : competent cell半融就將10ul的ligation product加進去 : 放在冰上30min : 接著做heat shock,42度C,90s : 冰上3分鐘 : 接著加700ul的LB buffer(無 Ampicillim),37度C,1hr : 7000rpm離心2min : 抽掉上清液留下pellet,再加75ulLB buffer(無 Ampicillin) resuspension : 最後塗盤(100ug/ml Ampicillin) : 16hr之後收盤 : 都沒有長... : 請問我的實驗的問題出在哪裡>"< : 請高手出手相救 感激不盡 : 最後還是再次感謝大家的幫助 希望本篇也可以幫助其他cloning做不出來的人^___^ ※ 編輯: flyhuman 來自: 140.116.253.121 (05/06 12:31) : 推 HEK293:先positive control確定transform沒問題，然後再確認 05/06 12:42 : → HEK293:ligation沒問題(PC)，然後其實切兩個小時EcoRI不會怎樣 05/06 12:43 : → HEK293:ligation體積可以放大到20uL，感覺不是步驟的問題 05/06 12:45 : → HEK293:看看材料方面有沒有狀況吧。ligase buffer壞了之類的(猜) 05/06 12:45 : → gryou:ligation 溫度？ 05/06 13:11 : 推 shenhsu:如果一直接不起來 我建議你把PCR產物再接一次到TA上 這樣 05/06 13:12 : → shenhsu:至少能確定digest沒問題 我實在不怎麼信任PCR產物直接切 05/06 13:13 : → shenhsu:heat shock 90s會不會太久?! 我看到建議的都低於60s耶... 05/06 13:15 : → jk15:heat shock建議不要超過45S... ligation試試看4度O/N 05/06 14:56 : 推 leoblack:我家lab就是90s效果比45s好~ 05/06 15:18 : 推 dodomilk:#1Dk6LayG 參考一下 05/06 15:20 : → flyhuman:抱歉>"< ligation是4度C overnight 05/06 15:56 : 推 leoblack:我以為ligation都是12~16度C o/n的說 05/06 17:09 : 推 inchew:vector兩切位如果緊鄰或太近，要分開切不要一起切；要確定 05/06 17:20 : → inchew:primer設計的切位兩側至少要多幾個bp，RE才比較切得成功。 05/06 17:23 : → inchew:我cloning通常失敗是敗在RE cleavage這一步，後續反而還好 05/06 17:24 : 推 icome:insert切40min也太短了吧 至少兩小時 若有加BSA不至於亂切 05/06 19:59 : → icome:我之前還切過一個晚上的 結果沒事 05/06 20:00 : 推 yaliu:請問轉形效率好嗎？還有也可以用PCR來確認ligation步驟喔 05/06 20:45 : → yaliu:不過ligation產物不好PCR就是了 05/06 20:45 : → yaliu:還有PCR產物你這樣切40分鐘～很危險..有很大的機率沒切乾淨 05/06 20:46 : → yaliu:如果是我我會切2小時～當然酵素量要夠 05/06 20:47 : 推 musicman:EcoRI切個1.5hr以上吧 不會亂切啦, 大概load 2ug下去切 05/06 23:06 : 推 Realthugz:偷切一管長時間的看看 先不要讓老闆知道 05/06 23:15 : 推 qumai:EcoRI應該還好啦~ 我放過夜也沒事@@ 05/07 14:28 : → qumai:Ligase會有問題嗎 要不要換一下 05/07 14:29 --

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