感谢各位的帮助 我做了以下的修改终於有长了~ (虽然还不知道送进去的是不是对的,但至少有送进去^^") ※ 引述《flyhuman (睡魔海 )》之铭言： : 我的insert大小是1050bp vector大小是9193bp : insert已经接到TA vector上 定序也确定序列都对 : 现在是设计带有EcoRI跟XbaI restriction site的primer : forward:gctctagagc-atg....... : reverse:cggaattccg-tta....... : 然後经过PCR放大insert之後 做一次DNA elution : 再来将insert跟vector作RE,37度C,40min : (之所以会切这麽短时间,因为老板说放太久EcoRI会乱切...) RE的时间我调整成1hr : 然後65度C inactivation,15min : 之後拿去run gel : 作gel elution : 测完浓度之後准备作ligation : insert跟vector浓度大都在50ng/ul : 我的vector input 75ng : 我已经试过molar ratio vector:insert=1:3,1:5,1:10 :1:5有长~1:10也有长(但是我是改用体积比...) : 然後T4 DNA ligase 1ul,2 X buffer 5ul : 总体积10ul, ligation overnight 跟别人借了TAKARA的T4 DNA ligase ligase 0.5ul, 10X buffer 1ul, insert跟vector相对可以加比较多 总体积依旧是10ul, ligation 4度C overnight : 隔天做transformation : competent cell是用益生的DH10B 也用过JM109 这次作了两组对照组 DH10B只长1颗 JM109长了10颗 有人用过DH10B吗??? 之前用DH10B作TA就做得出来 但是现在用ligation product就做不出来了 是不是competent cell的问题??? (当初好像买错= = 本来是要买DH5alpha的) : 之前有做过转空vector进去有成功 : transform的过程: : competent cell半融就将10ul的ligation product加进去 : 放在冰上30min : 接着做heat shock,42度C,90s : 冰上3分钟 : 接着加700ul的LB buffer(无 Ampicillim),37度C,1hr : 7000rpm离心2min : 抽掉上清液留下pellet,再加75ulLB buffer(无 Ampicillin) resuspension : 最後涂盘(100ug/ml Ampicillin) : 16hr之後收盘 : 都没有长... : 请问我的实验的问题出在哪里>"< : 请高手出手相救 感激不尽 : 最後还是再次感谢大家的帮助 希望本篇也可以帮助其他cloning做不出来的人^___^ ※ 编辑: flyhuman 来自: 140.116.253.121 (05/06 12:31) : 推 HEK293:先positive control确定transform没问题，然後再确认 05/06 12:42 : → HEK293:ligation没问题(PC)，然後其实切两个小时EcoRI不会怎样 05/06 12:43 : → HEK293:ligation体积可以放大到20uL，感觉不是步骤的问题 05/06 12:45 : → HEK293:看看材料方面有没有状况吧。ligase buffer坏了之类的(猜) 05/06 12:45 : → gryou:ligation 温度？ 05/06 13:11 : 推 shenhsu:如果一直接不起来 我建议你把PCR产物再接一次到TA上 这样 05/06 13:12 : → shenhsu:至少能确定digest没问题 我实在不怎麽信任PCR产物直接切 05/06 13:13 : → shenhsu:heat shock 90s会不会太久?! 我看到建议的都低於60s耶... 05/06 13:15 : → jk15:heat shock建议不要超过45S... ligation试试看4度O/N 05/06 14:56 : 推 leoblack:我家lab就是90s效果比45s好~ 05/06 15:18 : 推 dodomilk:#1Dk6LayG 参考一下 05/06 15:20 : → flyhuman:抱歉>"< ligation是4度C overnight 05/06 15:56 : 推 leoblack:我以为ligation都是12~16度C o/n的说 05/06 17:09 : 推 inchew:vector两切位如果紧邻或太近，要分开切不要一起切；要确定 05/06 17:20 : → inchew:primer设计的切位两侧至少要多几个bp，RE才比较切得成功。 05/06 17:23 : → inchew:我cloning通常失败是败在RE cleavage这一步，後续反而还好 05/06 17:24 : 推 icome:insert切40min也太短了吧 至少两小时 若有加BSA不至於乱切 05/06 19:59 : → icome:我之前还切过一个晚上的 结果没事 05/06 20:00 : 推 yaliu:请问转形效率好吗？还有也可以用PCR来确认ligation步骤喔 05/06 20:45 : → yaliu:不过ligation产物不好PCR就是了 05/06 20:45 : → yaliu:还有PCR产物你这样切40分钟～很危险..有很大的机率没切乾净 05/06 20:46 : → yaliu:如果是我我会切2小时～当然酵素量要够 05/06 20:47 : 推 musicman:EcoRI切个1.5hr以上吧 不会乱切啦, 大概load 2ug下去切 05/06 23:06 : 推 Realthugz:偷切一管长时间的看看 先不要让老板知道 05/06 23:15 : 推 qumai:EcoRI应该还好啦~ 我放过夜也没事@@ 05/07 14:28 : → qumai:Ligase会有问题吗 要不要换一下 05/07 14:29 --

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