作者flyhuman (睡魔海 )
看板Biotech
標題[求救] Ligation一直接不出來...
時間Fri May 6 12:29:32 2011
我的insert大小是1050bp vector大小是9193bp
insert已經接到TA vector上 定序也確定序列都對
現在是設計帶有EcoRI跟XbaI restriction site的primer
forward:gctctagagc-atg.......
reverse:cggaattccg-tta.......
然後經過PCR放大insert之後 做一次DNA elution
再來將insert跟vector作RE,37度C,40min
(之所以會切這麼短時間,因為老闆說放太久EcoRI會亂切...)
然後65度C inactivation,15min
之後拿去run gel
作gel elution
測完濃度之後準備作ligation
insert跟vector濃度大都在50ng/ul
我的vector input 75ng
我已經試過molar ratio vector:insert=1:3,1:5,1:10
然後T4 DNA ligase 1ul,2 X buffer 5ul
總體積10ul, ligation overnight
隔天做transformation
competent cell是用益生的DH10B 也用過JM109
之前有做過轉空vector進去有成功
transform的過程:
competent cell半融就將10ul的ligation product加進去
放在冰上30min
接著做heat shock,42度C,90s
冰上3分鐘
接著加700ul的LB buffer(無 Ampicillim),37度C,1hr
7000rpm離心2min
抽掉上清液留下pellet,再加75ulLB buffer(無 Ampicillin) resuspension
最後塗盤(100ug/ml Ampicillin)
16hr之後收盤
都沒有長...
請問我的實驗的問題出在哪裡>"<
請高手出手相救 感激不盡
※ 編輯: flyhuman 來自: 140.116.253.121 (05/06 12:31)
1F：推 HEK293:先positive control確定transform沒問題，然後再確認 05/06 12:42
2F：→ HEK293:ligation沒問題(PC)，然後其實切兩個小時EcoRI不會怎樣 05/06 12:43
3F：→ HEK293:ligation體積可以放大到20uL，感覺不是步驟的問題 05/06 12:45
4F：→ HEK293:看看材料方面有沒有狀況吧。ligase buffer壞了之類的(猜) 05/06 12:45
5F：→ gryou:ligation 溫度？ 05/06 13:11
6F：推 shenhsu:如果一直接不起來 我建議你把PCR產物再接一次到TA上 這樣 05/06 13:12
7F：→ shenhsu:至少能確定digest沒問題 我實在不怎麼信任PCR產物直接切 05/06 13:13
8F：→ shenhsu:heat shock 90s會不會太久?! 我看到建議的都低於60s耶... 05/06 13:15
9F：→ jk15:heat shock建議不要超過45S... ligation試試看4度O/N 05/06 14:56
10F：推 leoblack:我家lab就是90s效果比45s好~ 05/06 15:18
12F：→ flyhuman:抱歉>"< ligation是4度C overnight 05/06 15:56
13F：推 leoblack:我以為ligation都是12~16度C o/n的說 05/06 17:09
14F：推 inchew:vector兩切位如果緊鄰或太近，要分開切不要一起切；要確定 05/06 17:20
15F：→ inchew:primer設計的切位兩側至少要多幾個bp，RE才比較切得成功。 05/06 17:23
16F：→ inchew:我cloning通常失敗是敗在RE cleavage這一步，後續反而還好 05/06 17:24
17F：推 icome:insert切40min也太短了吧 至少兩小時 若有加BSA不至於亂切 05/06 19:59
18F：→ icome:我之前還切過一個晚上的 結果沒事 05/06 20:00
19F：推 yaliu:請問轉形效率好嗎？還有也可以用PCR來確認ligation步驟喔 05/06 20:45
20F：→ yaliu:不過ligation產物不好PCR就是了 05/06 20:45
21F：→ yaliu:還有PCR產物你這樣切40分鐘～很危險..有很大的機率沒切乾淨 05/06 20:46
22F：→ yaliu:如果是我我會切2小時～當然酵素量要夠 05/06 20:47
23F：推 musicman:EcoRI切個1.5hr以上吧 不會亂切啦, 大概load 2ug下去切 05/06 23:06
24F：推 Realthugz:偷切一管長時間的看看 先不要讓老闆知道 05/06 23:15
25F：推 qumai:EcoRI應該還好啦~ 我放過夜也沒事@@ 05/07 14:28
26F：→ qumai:Ligase會有問題嗎 要不要換一下 05/07 14:29
27F：推 ennnnno:看看Ligase有沒有問題~我之前一直做不出來就是ligase壞掉 05/09 20:20
28F：推 ararthur:有個問題 你拿多少DNA去做gel extract? 測濃度50ng/ul有 05/12 14:49
29F：→ ararthur:順便寄他的260/230嗎?怕是沒DNA 只是鹽類的peak太高而已 05/12 14:50