作者flyhuman (睡魔海 )
看板Biotech
标题[求救] Ligation一直接不出来...
时间Fri May 6 12:29:32 2011
我的insert大小是1050bp vector大小是9193bp
insert已经接到TA vector上 定序也确定序列都对
现在是设计带有EcoRI跟XbaI restriction site的primer
forward:gctctagagc-atg.......
reverse:cggaattccg-tta.......
然後经过PCR放大insert之後 做一次DNA elution
再来将insert跟vector作RE,37度C,40min
(之所以会切这麽短时间,因为老板说放太久EcoRI会乱切...)
然後65度C inactivation,15min
之後拿去run gel
作gel elution
测完浓度之後准备作ligation
insert跟vector浓度大都在50ng/ul
我的vector input 75ng
我已经试过molar ratio vector:insert=1:3,1:5,1:10
然後T4 DNA ligase 1ul,2 X buffer 5ul
总体积10ul, ligation overnight
隔天做transformation
competent cell是用益生的DH10B 也用过JM109
之前有做过转空vector进去有成功
transform的过程:
competent cell半融就将10ul的ligation product加进去
放在冰上30min
接着做heat shock,42度C,90s
冰上3分钟
接着加700ul的LB buffer(无 Ampicillim),37度C,1hr
7000rpm离心2min
抽掉上清液留下pellet,再加75ulLB buffer(无 Ampicillin) resuspension
最後涂盘(100ug/ml Ampicillin)
16hr之後收盘
都没有长...
请问我的实验的问题出在哪里>"<
请高手出手相救 感激不尽
※ 编辑: flyhuman 来自: 140.116.253.121 (05/06 12:31)
1F：推 HEK293:先positive control确定transform没问题，然後再确认 05/06 12:42
2F：→ HEK293:ligation没问题(PC)，然後其实切两个小时EcoRI不会怎样 05/06 12:43
3F：→ HEK293:ligation体积可以放大到20uL，感觉不是步骤的问题 05/06 12:45
4F：→ HEK293:看看材料方面有没有状况吧。ligase buffer坏了之类的(猜) 05/06 12:45
5F：→ gryou:ligation 温度？ 05/06 13:11
6F：推 shenhsu:如果一直接不起来 我建议你把PCR产物再接一次到TA上 这样 05/06 13:12
7F：→ shenhsu:至少能确定digest没问题 我实在不怎麽信任PCR产物直接切 05/06 13:13
8F：→ shenhsu:heat shock 90s会不会太久?! 我看到建议的都低於60s耶... 05/06 13:15
9F：→ jk15:heat shock建议不要超过45S... ligation试试看4度O/N 05/06 14:56
10F：推 leoblack:我家lab就是90s效果比45s好~ 05/06 15:18
12F：→ flyhuman:抱歉>"< ligation是4度C overnight 05/06 15:56
13F：推 leoblack:我以为ligation都是12~16度C o/n的说 05/06 17:09
14F：推 inchew:vector两切位如果紧邻或太近，要分开切不要一起切；要确定 05/06 17:20
15F：→ inchew:primer设计的切位两侧至少要多几个bp，RE才比较切得成功。 05/06 17:23
16F：→ inchew:我cloning通常失败是败在RE cleavage这一步，後续反而还好 05/06 17:24
17F：推 icome:insert切40min也太短了吧 至少两小时 若有加BSA不至於乱切 05/06 19:59
18F：→ icome:我之前还切过一个晚上的 结果没事 05/06 20:00
19F：推 yaliu:请问转形效率好吗？还有也可以用PCR来确认ligation步骤喔 05/06 20:45
20F：→ yaliu:不过ligation产物不好PCR就是了 05/06 20:45
21F：→ yaliu:还有PCR产物你这样切40分钟～很危险..有很大的机率没切乾净 05/06 20:46
22F：→ yaliu:如果是我我会切2小时～当然酵素量要够 05/06 20:47
23F：推 musicman:EcoRI切个1.5hr以上吧 不会乱切啦, 大概load 2ug下去切 05/06 23:06
24F：推 Realthugz:偷切一管长时间的看看 先不要让老板知道 05/06 23:15
25F：推 qumai:EcoRI应该还好啦~ 我放过夜也没事@@ 05/07 14:28
26F：→ qumai:Ligase会有问题吗 要不要换一下 05/07 14:29
27F：推 ennnnno:看看Ligase有没有问题~我之前一直做不出来就是ligase坏掉 05/09 20:20
28F：推 ararthur:有个问题 你拿多少DNA去做gel extract? 测浓度50ng/ul有 05/12 14:49
29F：→ ararthur:顺便寄他的260/230吗?怕是没DNA 只是盐类的peak太高而已 05/12 14:50