作者premire (熱騰騰的泡麵)
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標題Re: [求救] 有沒有人用過gel filtration???
時間Mon May 2 18:02:21 2011
原文恕刪
參考了sephadex產品說明書 其中一段如下：
Use 0.15 M NaCl or a buffer with equivalent ionic strength to avoid pH
dependent nonionic interactions with the matrix. At very low ionic strength,
the presence of a small number of negatively charged groups may cause
retardation of basic proteins and exclusion of acidic proteins.
根據以上我的解讀是column的metrix是dextran, 帶有負電荷OH group,在極低的離子強度
假如sample帶有正負電荷都會和metrix產生吸附或是排斥現象.因此必須要使用0.15M鹽類
增加buffer的離子強度,減少sample與metrix的交互作用.
另外有提到
When working with a new sample, try these conditions first: 0.05 M sodium
phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.0 or select the buffer into which the product should be
eluted for the next step (e.g., further purification, analysis, or storage.)
意即使用時建議先試試看0.05M sodium phosphate + 0.15 M NaCl
問題來了！之前使用的buffer組成為D-PBS,本身緩衝濃度Sodium Phosphate Dibasic
8.10 mM, Potassium Phosphate Monobasic 1.47 mM, Sodium Chloride 138 mM
分離結果是看不到後面的小分子elute out
問題1:若改為說明書建議的配方, NaCl濃度沒差多少,而是差在緩衝溶液的濃度(50 mM)會不會
對於我的分離結果會有改善呢
問題2:我的大分子是SOD,在pH 7.4環境下應該不會帶特定電荷, 還需要這麼高（0.15M）
鹽類嗎？
由於sample快沒了 每一次的使用都盡量力求效率 請有經驗的大大指教！！！
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◆ From: 210.60.122.10
1F：推 jason0919:鹽濃度和分離效率無關 只要你的東西可以流的出來就好 05/02 20:20
2F：→ jason0919:我沒特別加NaCl 用這種column也是可以分離 關鍵是你的溶 05/02 20:21
3F：→ jason0919:液的離子性夠大到讓你的蛋白不會黏在管柱上 05/02 20:22
4F：→ jason0919:你可以先try 只打buffer進去看小分子什麼時候流出來 05/02 20:23
5F：→ jason0919:還沒聽過小分子也流不出來的 既然你用手動 你怎麼detect 05/02 20:24
6F：→ jason0919:你的小分子? 05/02 20:24
7F：→ jason0919:照你的講法是用手動 你用導電度計測變化? 05/02 20:34
8F：→ premire:回j大 利用UV detect 05/03 01:09
9F：→ premire:所以j大之前的buffer是只有sodium phosphate不含NaCl囉？ 05/03 13:21
10F：推 jason0919:前兩篇已經說明了 280nm吸收看不到glutathione 05/03 16:15
11F：推 jason0919:就算是用214, 220nm這些對有單鍵的東西吸收都很高 看不 05/03 16:19
12F：→ jason0919:到變化也是正常的 05/03 16:20
13F：→ premire:目前想法是看230附近的吸光值,因為buffer不太會有吸光值, 05/03 18:05
14F：→ premire:假如打純的GSH看到後面fraction在230附近有吸收,我也可以 05/03 18:05
15F：→ premire:認定大小分子確實有分離 05/03 18:06
16F：推 jason0919:您為何不加glutathione到buffer裡 看看吸光值有何變化 05/03 18:43
17F：→ jason0919:但我不太認為你會看的到 05/03 18:44
18F：→ jason0919:想了一下 搞不好可以 05/03 18:53
19F：→ jason0919:我只是很好奇你為什麼會想用吸收值來看它 05/03 18:56
20F：→ jason0919:230不是一個很好的地方啊 頗少看到人看這個點 05/03 18:58
21F：→ jason0919:如果你看到說明書 大概都是在用導電度看 最直覺 05/03 19:11
22F：→ premire:收集的fraction自然就有GSH＋buffer,另外想用UV的原因是想 05/03 19:12
23F：→ premire:看到大分子小分子有先後分開的peak 05/03 19:15