作者premire (热腾腾的泡面)
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标题Re: [求救] 有没有人用过gel filtration???
时间Mon May 2 18:02:21 2011
原文恕删
参考了sephadex产品说明书 其中一段如下：
Use 0.15 M NaCl or a buffer with equivalent ionic strength to avoid pH
dependent nonionic interactions with the matrix. At very low ionic strength,
the presence of a small number of negatively charged groups may cause
retardation of basic proteins and exclusion of acidic proteins.
根据以上我的解读是column的metrix是dextran, 带有负电荷OH group,在极低的离子强度
假如sample带有正负电荷都会和metrix产生吸附或是排斥现象.因此必须要使用0.15M盐类
增加buffer的离子强度,减少sample与metrix的交互作用.
另外有提到
When working with a new sample, try these conditions first: 0.05 M sodium
phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.0 or select the buffer into which the product should be
eluted for the next step (e.g., further purification, analysis, or storage.)
意即使用时建议先试试看0.05M sodium phosphate + 0.15 M NaCl
问题来了！之前使用的buffer组成为D-PBS,本身缓冲浓度Sodium Phosphate Dibasic
8.10 mM, Potassium Phosphate Monobasic 1.47 mM, Sodium Chloride 138 mM
分离结果是看不到後面的小分子elute out
问题1:若改为说明书建议的配方, NaCl浓度没差多少,而是差在缓冲溶液的浓度(50 mM)会不会
对於我的分离结果会有改善呢
问题2:我的大分子是SOD,在pH 7.4环境下应该不会带特定电荷, 还需要这麽高（0.15M）
盐类吗？
由於sample快没了 每一次的使用都尽量力求效率 请有经验的大大指教！！！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 210.60.122.10
1F：推 jason0919:盐浓度和分离效率无关 只要你的东西可以流的出来就好 05/02 20:20
2F：→ jason0919:我没特别加NaCl 用这种column也是可以分离 关键是你的溶 05/02 20:21
3F：→ jason0919:液的离子性够大到让你的蛋白不会黏在管柱上 05/02 20:22
4F：→ jason0919:你可以先try 只打buffer进去看小分子什麽时候流出来 05/02 20:23
5F：→ jason0919:还没听过小分子也流不出来的 既然你用手动 你怎麽detect 05/02 20:24
6F：→ jason0919:你的小分子? 05/02 20:24
7F：→ jason0919:照你的讲法是用手动 你用导电度计测变化? 05/02 20:34
8F：→ premire:回j大 利用UV detect 05/03 01:09
9F：→ premire:所以j大之前的buffer是只有sodium phosphate不含NaCl罗？ 05/03 13:21
10F：推 jason0919:前两篇已经说明了 280nm吸收看不到glutathione 05/03 16:15
11F：推 jason0919:就算是用214, 220nm这些对有单键的东西吸收都很高 看不 05/03 16:19
12F：→ jason0919:到变化也是正常的 05/03 16:20
13F：→ premire:目前想法是看230附近的吸光值,因为buffer不太会有吸光值, 05/03 18:05
14F：→ premire:假如打纯的GSH看到後面fraction在230附近有吸收,我也可以 05/03 18:05
15F：→ premire:认定大小分子确实有分离 05/03 18:06
16F：推 jason0919:您为何不加glutathione到buffer里 看看吸光值有何变化 05/03 18:43
17F：→ jason0919:但我不太认为你会看的到 05/03 18:44
18F：→ jason0919:想了一下 搞不好可以 05/03 18:53
19F：→ jason0919:我只是很好奇你为什麽会想用吸收值来看它 05/03 18:56
20F：→ jason0919:230不是一个很好的地方啊 颇少看到人看这个点 05/03 18:58
21F：→ jason0919:如果你看到说明书 大概都是在用导电度看 最直觉 05/03 19:11
22F：→ premire:收集的fraction自然就有GSH＋buffer,另外想用UV的原因是想 05/03 19:12
23F：→ premire:看到大分子小分子有先後分开的peak 05/03 19:15