作者resistor (resistor)
看板Biotech
標題[求救] EGF stimulation
時間Sun May 1 01:08:25 2011
請問有人用EGF刺激H1299或其他肺癌細胞嗎?
實驗中要用EGF刺激下游的AKT.ERK表現
想要間接證明細胞膜上的EGFR受藥物影響
但control組本身AKT.ERK的表現量很高
導致加入EGF後看不出差異
參考文獻後發現
每篇control的EGFR.AKT.ERK的表現量差異很大
有的幾乎沒表現
有的刺激前後沒太大差異 表現量都蠻高的
paper對加EGF的部份並沒有很詳細的描述
所以想請教大家
加入EGF前需要把medium換成serum free 還是直接加入就好
細胞數對EGF刺激的結果是否有影響
因為要處理藥物加上要收western用的sample
所以種的細胞數很多 3x10^6/10 cm dish
就EGFR.pEGFR的部份
抽膜蛋白結果是否會更準確? paper上似乎都沒有提到這點
請有經驗的高手提供我一些意見了
謝謝
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◆ From: 118.167.168.48
1F：→ genep:通常都會starvation, 因為FBS裡也很多growth factor會影響. 05/01 04:14
2F：→ genep:lysis buffer中有detergent(SDS)的話通常都可以收到膜蛋白 05/01 04:16
3F：→ genep:不過我沒試過沒加的. 05/01 04:17
4F：→ reinherd:AKT建議看phosphorylation,量不一定準 05/01 13:19
5F：→ reinherd:另外在乳癌的研究文獻上,看AKT前似乎都會做starvation 05/01 13:20
6F：→ reinherd:我對receptor不熟,但是我們實驗室的其他人玩estrogen 05/01 13:21
7F：→ reinherd:receptor用millipore的RIPA有不錯的結果,不然膜蛋白可以 05/01 13:22
8F：→ reinherd:用sonication來輔助抽取. 05/01 13:22
9F：→ reinherd:此外如果你想證明"膜上"這種localization,建議用confocal 05/01 13:23
10F：→ resistor:請問一般starvation的時間大概多久? 05/01 22:20
11F：→ genep:我的經驗是overnight(12-16h)先試, 然後看細胞狀況調整. 05/02 04:54