作者resistor (resistor)
看板Biotech
标题[求救] EGF stimulation
时间Sun May 1 01:08:25 2011
请问有人用EGF刺激H1299或其他肺癌细胞吗?
实验中要用EGF刺激下游的AKT.ERK表现
想要间接证明细胞膜上的EGFR受药物影响
但control组本身AKT.ERK的表现量很高
导致加入EGF後看不出差异
参考文献後发现
每篇control的EGFR.AKT.ERK的表现量差异很大
有的几乎没表现
有的刺激前後没太大差异 表现量都蛮高的
paper对加EGF的部份并没有很详细的描述
所以想请教大家
加入EGF前需要把medium换成serum free 还是直接加入就好
细胞数对EGF刺激的结果是否有影响
因为要处理药物加上要收western用的sample
所以种的细胞数很多 3x10^6/10 cm dish
就EGFR.pEGFR的部份
抽膜蛋白结果是否会更准确? paper上似乎都没有提到这点
请有经验的高手提供我一些意见了
谢谢
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◆ From: 118.167.168.48
1F：→ genep:通常都会starvation, 因为FBS里也很多growth factor会影响. 05/01 04:14
2F：→ genep:lysis buffer中有detergent(SDS)的话通常都可以收到膜蛋白 05/01 04:16
3F：→ genep:不过我没试过没加的. 05/01 04:17
4F：→ reinherd:AKT建议看phosphorylation,量不一定准 05/01 13:19
5F：→ reinherd:另外在乳癌的研究文献上,看AKT前似乎都会做starvation 05/01 13:20
6F：→ reinherd:我对receptor不熟,但是我们实验室的其他人玩estrogen 05/01 13:21
7F：→ reinherd:receptor用millipore的RIPA有不错的结果,不然膜蛋白可以 05/01 13:22
8F：→ reinherd:用sonication来辅助抽取. 05/01 13:22
9F：→ reinherd:此外如果你想证明"膜上"这种localization,建议用confocal 05/01 13:23
10F：→ resistor:请问一般starvation的时间大概多久? 05/01 22:20
11F：→ genep:我的经验是overnight(12-16h)先试, 然後看细胞状况调整. 05/02 04:54