作者yummy770 (keep in touch)
看板Biotech
標題[求救] site-directed mutagenesis
時間Fri Apr 29 20:42:51 2011
各位前輩大家好，
最近實驗室在進行將wild-type細胞改造成mutation type的細胞株
由於實驗室除了教授外，目前只有我一人> <，所以來這邊詢問各位。
查了很多資料，但都沒有這方面的資訊。
可能我用的key word不夠準確。(ex establish mutation cell)。
所以來這邊請教各位。
我已經有初步的想法
先將wild type cell cDNA clone到pCDNA3.3 TOPO的vector內，
再利用quikchange kit進行基因突變
最後轉染到wildtype的細胞內。
我想請問各位的是 當我設計cDNA primer時，是否要增幅full-lengh或者只需要設計
將要進行突變的exon部分??
謝謝大家!!!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 118.160.148.226
1F：推 aceliang:CDS即可。 04/29 21:58
2F：→ vm212:樓上的前輩非常感謝您。我還有個問題想請教(因為實在是新手) 04/29 23:20
3F：→ vm212:所謂CDS的意思是說從CDS到stop codon嗎? 04/29 23:22
4F：→ yummy770:謝謝學長(姊)幫忙~~ 04/29 23:29
5F：→ yummy770:此外，我想問前輩如果要進行上述的實驗，我可以clone DNA 04/29 23:30
6F：→ yummy770:還是必須使用cDNA? (所謂DNA是RT-PCR後的DNA??_) 04/29 23:31
7F：→ dodomilk:三樓，CDS最後不是stop codon嗎？ 04/29 23:43
8F：推 dodomilk:五六樓的意思不太懂 總之就是RT-PCR後，設計CDS的primer 04/29 23:46
9F：→ dodomilk:把CDS夾出來之後，切一切接到vector裡面 04/29 23:47
10F：→ yummy770:喔~~~樓上的學長(姊)我懂了..就是可以接RT-PCR後的產物!! 04/29 23:56
11F：推 Realthugz:你的cDNA primer就是夾coding的地方吧 你所謂的exon 04/29 23:59
12F：→ Realthugz:P出來clone到plasmid上再用mutagenesis的primer 04/29 23:59
13F：→ Realthugz:此primer的設計請參考protocol 就這麼簡單 04/30 00:00
14F：推 Realthugz:所以RT之後PCR及mutation共用到兩組不同的primer 04/30 00:05
15F：推 dodomilk:RT-PCR之後是cDNA，cDNA中的CDS才是你要接進去的... 04/30 01:04
16F：→ dodomilk:教授不是做分生的嗎？ 這樣的問題應該可以問教授吧？ 04/30 01:05
17F：→ dodomilk:改一下，RT-PCR之後是cDNA，cDNA中的CDS才是你要接進去的 04/30 01:06
18F：→ dodomilk:沒改到..RT-PCR產物是cDNA，cDNA中的CDS才是你要接進去的 04/30 01:07
19F：→ yummy770:sorry~~教授不是分生的~~他是電機的~~~ 04/30 09:26
20F：→ yummy770:我因為也不是本科系的~~所以 才來這邊求助大家!謝謝~~ 04/30 09:28
21F：→ yummy770:因為我一直以為作完RT的產物是cDNA，PCR後才是DNA。 04/30 09:29
22F：推 icome:電機系? 跨真大 @@ 04/30 10:43
23F：推 dodomilk:嗯...其實我覺得你好像還沒完全瞭解的樣子... 04/30 10:54
24F：→ dodomilk:我沒實際操作過RT-PCR，這方面的步驟還請熟悉的版友解答 04/30 10:55
25F：→ blence:文章看不出來是要做mutant transgene(將壞的基因送到細胞) 04/30 14:30
26F：→ blence:還是gene targeting(將細胞內原有正常基因置換成mutant) 04/30 14:30
27F：推 dodomilk:說的對...gene targeting完全是另一種做法... 04/30 14:33
28F：→ blence:如果完成實驗的目標還是親自找校內其它實驗室合作,免得兩個 04/30 14:35
29F：→ blence:分生不了解的,就算有成功還不見得是你們認為的 04/30 14:36
30F：→ blence:不是想低估非本科系的就做不出來,而是前面po文就知道不簡單 04/30 14:38
31F：→ williamyang:或是用RNAi打掉內生性蛋白,在同時表達RNAi resistant 04/30 15:35
32F：→ williamyang:的mutant protein. 04/30 15:36
33F：推 Realthugz:cDNA跟PCR product都是dsDNA :) 04/30 22:43
34F：→ Realthugz:原PO可能要把central dogma稍微看一遍有個概念 04/30 22:44
35F：→ Realthugz:不然就算知道要去查molecular cloning也不一定看懂 04/30 22:45