作者yummy770 (keep in touch)
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标题[求救] site-directed mutagenesis
时间Fri Apr 29 20:42:51 2011
各位前辈大家好，
最近实验室在进行将wild-type细胞改造成mutation type的细胞株
由於实验室除了教授外，目前只有我一人> <，所以来这边询问各位。
查了很多资料，但都没有这方面的资讯。
可能我用的key word不够准确。(ex establish mutation cell)。
所以来这边请教各位。
我已经有初步的想法
先将wild type cell cDNA clone到pCDNA3.3 TOPO的vector内，
再利用quikchange kit进行基因突变
最後转染到wildtype的细胞内。
我想请问各位的是 当我设计cDNA primer时，是否要增幅full-lengh或者只需要设计
将要进行突变的exon部分??
谢谢大家!!!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 118.160.148.226
1F：推 aceliang:CDS即可。 04/29 21:58
2F：→ vm212:楼上的前辈非常感谢您。我还有个问题想请教(因为实在是新手) 04/29 23:20
3F：→ vm212:所谓CDS的意思是说从CDS到stop codon吗? 04/29 23:22
4F：→ yummy770:谢谢学长(姊)帮忙~~ 04/29 23:29
5F：→ yummy770:此外，我想问前辈如果要进行上述的实验，我可以clone DNA 04/29 23:30
6F：→ yummy770:还是必须使用cDNA? (所谓DNA是RT-PCR後的DNA??_) 04/29 23:31
7F：→ dodomilk:三楼，CDS最後不是stop codon吗？ 04/29 23:43
8F：推 dodomilk:五六楼的意思不太懂 总之就是RT-PCR後，设计CDS的primer 04/29 23:46
9F：→ dodomilk:把CDS夹出来之後，切一切接到vector里面 04/29 23:47
10F：→ yummy770:喔~~~楼上的学长(姊)我懂了..就是可以接RT-PCR後的产物!! 04/29 23:56
11F：推 Realthugz:你的cDNA primer就是夹coding的地方吧 你所谓的exon 04/29 23:59
12F：→ Realthugz:P出来clone到plasmid上再用mutagenesis的primer 04/29 23:59
13F：→ Realthugz:此primer的设计请参考protocol 就这麽简单 04/30 00:00
14F：推 Realthugz:所以RT之後PCR及mutation共用到两组不同的primer 04/30 00:05
15F：推 dodomilk:RT-PCR之後是cDNA，cDNA中的CDS才是你要接进去的... 04/30 01:04
16F：→ dodomilk:教授不是做分生的吗？ 这样的问题应该可以问教授吧？ 04/30 01:05
17F：→ dodomilk:改一下，RT-PCR之後是cDNA，cDNA中的CDS才是你要接进去的 04/30 01:06
18F：→ dodomilk:没改到..RT-PCR产物是cDNA，cDNA中的CDS才是你要接进去的 04/30 01:07
19F：→ yummy770:sorry~~教授不是分生的~~他是电机的~~~ 04/30 09:26
20F：→ yummy770:我因为也不是本科系的~~所以 才来这边求助大家!谢谢~~ 04/30 09:28
21F：→ yummy770:因为我一直以为作完RT的产物是cDNA，PCR後才是DNA。 04/30 09:29
22F：推 icome:电机系? 跨真大 @@ 04/30 10:43
23F：推 dodomilk:嗯...其实我觉得你好像还没完全了解的样子... 04/30 10:54
24F：→ dodomilk:我没实际操作过RT-PCR，这方面的步骤还请熟悉的版友解答 04/30 10:55
25F：→ blence:文章看不出来是要做mutant transgene(将坏的基因送到细胞) 04/30 14:30
26F：→ blence:还是gene targeting(将细胞内原有正常基因置换成mutant) 04/30 14:30
27F：推 dodomilk:说的对...gene targeting完全是另一种做法... 04/30 14:33
28F：→ blence:如果完成实验的目标还是亲自找校内其它实验室合作,免得两个 04/30 14:35
29F：→ blence:分生不了解的,就算有成功还不见得是你们认为的 04/30 14:36
30F：→ blence:不是想低估非本科系的就做不出来,而是前面po文就知道不简单 04/30 14:38
31F：→ williamyang:或是用RNAi打掉内生性蛋白,在同时表达RNAi resistant 04/30 15:35
32F：→ williamyang:的mutant protein. 04/30 15:36
33F：推 Realthugz:cDNA跟PCR product都是dsDNA :) 04/30 22:43
34F：→ Realthugz:原PO可能要把central dogma稍微看一遍有个概念 04/30 22:44
35F：→ Realthugz:不然就算知道要去查molecular cloning也不一定看懂 04/30 22:45